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bo血型改造制备通用型血中半乳糖苷酶的检测 -半乳液酶可从人b型红细胞表面糖链的末端-1和3糖苷键连接的-半乳液糖的残基中分解，将b-f-h作为h作为h作为h进行转化。因此,α-半乳糖苷酶是制备通用型血的关键工具酶。在完成B →O 血型改造后,引入工具酶的残留量对人体的安全性至关重要,因此有必要确定工具酶残留量的安全值,建立检测残留酶的方法,进而确定清除残留酶的洗涤程序。本研究观察了不同浓度残留酶对B型全血的影响,证明了残留酶量在300 ng/ml时对人体仍是安全的,据此我们把残留酶量的安全值定为10 ng/ml,并建立了检测微量残留α-半乳糖苷酶的方法。通过对洗涤液中残留酶量的检测,确定经过6～7次洗涤后,残留酶量可达到安全水平。 1 材料和方法 1.1 -半乳糖苷酶rad Amicon ultra 超滤管(MVCO 10000, 回收率90%);Kubota 2100离心机;Bio-Rad Model 550酶联仪;Bio-Rad电泳装置;丙烯酰胺(Sigma公司);甲叉丙烯酰胺(Serva公司);α-半乳糖苷酶标准品(购自Sigma公司,比活12.5 U/mg);12.5 mmol/L对-硝基-苯基-α-D-半乳吡喃糖苷;重组α-半乳糖苷酶(300 U/ml,纯度98%,比活100 U/mg);其他试剂为国产分析纯。 1.2 残留酶量对b型全血的残留血压病作用检测 分别按0.1,0.5,1.0,5.0,10.0,50.0,100.0,300.0 ng/ml的残留酶量,按1次输入300 ml通用型血,计算出总残留酶量,将计算出总残留酶量作用于2 ml B型全血,于37℃ 0,16,24,48,72 h观察血型改变情况。 1.3 检测微-半乳液酶 1.3.1 sds-采用银染和酶活性检测残留酶量 约130 ml通用型血1 000×g离心4 min,取上清作为被检样品,将被检样品超滤浓缩 (2 000×g离心20 min)约 500倍,取浓缩液进行SDS银染和酶活性检测残留酶量。对照组为未经α-半乳糖苷酶处理的B型红细胞。 1.3.2 变性电泳 配制SDS的5%浓缩胶,15%分离胶。取5 μl浓缩后样品与等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液混合,100℃变性5 min,上样,稳压180 V, 电泳1 h。电泳完成后凝胶置于40%乙醇,10%醋酸中固定10 min,加硫代硫酸钠(0.2 g/L)敏化1 min,双蒸水漂洗2次后,加0.1%硝酸银室温水平振摇20 min,双蒸水漂洗,加显色液(2.5%碳酸钠,0.0148%甲醛)显色2 min,5%醋酸终止显色。 1.3.3 酶活性检测方法 1.3.3. 苯基-d-半乳吡喃糖苷的合成 用0.2 mol/L柠檬酸和0.1 mol/L 磷酸氢二钠缓冲液将底物(对硝基-苯基α-D-半乳吡喃糖苷)配置成浓度为1.25 mmol/L的工作液,加入96孔板中,20 μl/孔,再加入不同浓度的待测样品,20 μl/孔,37 ℃作用1 h ,160 μl的硼酸-氢氧化钠溶液(pH 9.8) 终止反应,测定D405。 1.3.3. 半乳糖苷酶检测 α-半乳糖苷酶标准品以磷酸-柠檬酸缓冲液(0.1 mol/L柠檬酸30.75 ml,0.2 mol/L磷酸氢二钠69.25 ml,pH 6.5)进行倍比稀释,用上述方法测D405,并绘制α-半乳糖苷酶标准曲线。 1.3.3. 微量-半乳糖苷酶含量测定结果 对浓缩样品进行倍比稀释,测样品的D405,从标准曲线上,计算出样品中微量α-半乳糖苷酶含量。残留酶量(ng/ml)=活性(U/ml)/[比活(U/mg)×浓缩倍数]×106。 1.4 残留酶的制备 酶解后按生理盐水∶红细胞=1∶1比例清洗残留α-半乳糖苷酶,保留各次洗涤液,以SDS银染法和酶活法计算残酶量并绘制残留酶洗涤曲线。 2 结果 2.1 红细胞输血后b型全血的检测 用不同残留量的α-半乳糖苷酶作用于B型血,结果见表1。结果显示,以残留酶量300 ng/ml,按3个红细胞输血单位(300 ml)的总残留α-半乳糖苷酶作用于2 ml B型全血,72 h未出现B型血血清学的改变。说明即使当残酶量为300 ng/ml时对机体仍是安全的,为了确保输血安全,我们将残留酶量安全值定为10 ng/ml(安全剂量的1/30)。 2.2 -半乳液酶残留酶的检测 2.2.1 sds-采用银染和残留酶系统图见表1 5,10,25,50,100,200 ng的 α-半乳糖苷酶标准品,经SDS后银染,结果见图1。标准蛋白上样量50 ng可见明显条带,10～25 ng可见条带,10 ng银染肉眼看不到条带(图1,表2)。 浓缩的被检样品按同样方法进行SDS银染(图2),样品中α-半乳糖苷酶按下面公式计算:残留酶量[(最低蛋白可见