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毛细管气相色谱法测定莪术油在大鼠体内的分布特点 莪术油是中医学莪术根含有的挥发油，含量约为1%2.5%，是几种倍半类。其中，莪术醇、橄榄籽、莪术酮和莪术二酮具有抗癌和抗癌作用。本试验采用毛细管气相色谱法建立了以莪术醇为指标, 以α-香附酮为内标物的体内分析方法, 研究莪术油在大鼠的体内药物过程。 1 设备测试和动物 1.1 聚硅氧烷基复合材料fj-200 气相色谱仪:Agilent6890N;色谱柱DB-5石英毛细管柱 (0.32mm×30mm) ;填充液为5%苯基甲基聚硅氧烷, FID氢火焰检测器;载气为N2气;FJ-200高速分散匀质机 (上海标本模型厂) ;XW-80A微型涡旋混合仪 (上海沪西分析仪器厂有限公司) ;16C高速离心机 (上海安亭科学仪器厂) ;AS3120A超声波清洗仪。 1.2 药物专利 莪术油 (由大连华立金港药业有限公司提供) ;莪术醇 (购于上海沪云医药开发有限公司, 批号:13657-68-6, 纯度不低于99.6%) ;莪术二酮 (购于上海沪云医药开发有限公司, 批号:13657-68-6, 纯度不低于99.6%) ;甲醇、乙腈均为色谱醇,α-香附酮 (批号:110748-200602, 纯度不低于98.5%) , 二次蒸馏水。 1.3 实验动物及动物 SD大鼠雄性 (350±30)g, 雌性 (250±30)g[购于大连医科大学实验动物中心, 合格证号SCXK(辽) 2008-0002]。 2 方法和结果 2.1 度2 柱前压为50kPa;不分流;气化室温度280℃;检测器温度300℃;柱温采用程序升温:起始温度100℃, 以5℃·min-1升温至150℃, 再以30℃·min-1的升温速率, 升至200℃, 保持4min, 进样量为5μL。 2.2 储备液的制备 选用α-香附酮为内标物, 精密称取α-香附酮用甲醇配制成1.415mg·mL-1的溶液备用。精密量取莪术醇, 用甲醇稀释到6.57mg·mL-1作为储备液;精密量取莪术二酮, 用甲醇稀释到5.69mg·mL-1作为储备液。 2.3 标准曲线2.2 精密称取大鼠空白肝组织0.5g, 加入二次蒸馏水0.5mL, 高速匀浆10min, 精密加入内标液10μL, 涡旋2min, 精密加入乙醚1.5mL, 涡旋3min, 5000r·min-1离心10min, 精密吸取上清500μL, 40℃水浴吹干, 精密加入甲醇50μL, 涡旋1min, 吸取5μL上清液进样。 2.4 不同标准曲线 分别取大鼠空白肝脏组织7份, 加入适量体积的对照品储备液, 按照“2.1.3”方法处理, 制得莪术醇浓度0.002628, 0.00657, 0.01314, 0.02628, 0.05256, 0.1051, 0.2102mg·mL-1的样品;制得莪术二酮浓度0.0004552, 0.001138, 0.002276, 0.004552, 0.009104, 0.01821, 0.03642mg·mL-1的样品。进样5μL, 记录色谱图。分别以莪术醇浓度 (X) 与莪术醇与α-香附酮的峰面积比 (Y) , 以莪术二酮浓度 (X) 与莪术二酮与α-香附酮的峰面积比 (Y) 进行线性回归, 得莪术醇的标准曲线:Y=14.66·X-0.0641,r=0.989, 表明莪术醇在0.0004552～0.03642mg·mL-1范围内, 线性关系良好;莪术二酮的标准曲线:Y=37.95·X-0.0509,r=0.995, 表明莪术二酮在0.0004552～0.03642mg·mL-1范围内, 线性关系良好。 2.5 样品处理后样品的制备 大鼠空白肝脏加入莪术醇和莪术二酮对照品储备液及内标物之后, 按照“2.3”样品处理方法处理后吸取10μL进样, 与空白组织比较, 内源性杂质与对照品及内标物均分离良好, 色谱图见图1, 结果显示专属性较好。 2.6 方法的精密度 按照“2.3”组织样品处理方法, 分别配制0.00657, 0.02628, 0.1051mg·mL-1浓度的莪术醇空白肝脏样品。连续进样3天, 计算日内、日间精密度。结果显示, 日内精密度和日间精密度的RSD%分别为5.6, 11.7, 符合组织样品测定要求。分别配制0.001138, 0.004552, 0.01821mg·mL-1浓度的莪术二酮空白肝脏样品。连续进样3天, 计算日内、日间精密度。结果显示, 日内精和日间精密度的RSD%分别为6.8, 12.6, 符合组织样品测定要求。 2.7 不同种类肝脏的稳定性 分别取0.02628mg·mL-1浓度的莪术醇和0.004552mg·mL-1浓度的莪术二酮的空白肝脏样品各6份, 室温放置, 分别于0、1、2、4、6、8h和第1、2、3、4、5天进样