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肉鸡屠宰场沙门氏菌的分离鉴定 沙门氏菌是引起人类食物中毒的主要原因之一。美国1998—2002年大约有164 044例患者。我国70%~80%的细菌性食物中毒是由沙门氏菌引起的。其中,污染沙门氏菌的肉鸡制品是导致人类食物中毒的重要因素。对零售环节肉鸡制品的研究显示,其存在较高的污染率。随着经济的不断发展,我国肉鸡养殖和加工的规模化程度越来越高,了解养殖和屠宰加工环节肉鸡沙门氏菌污染状况是降低零售环节肉鸡沙门氏菌污染的重要途径。使用分子分型的方法可为食品安全事件(尤其是暴发疫情调查)中可疑食物及感染病例分离菌株进行有效的溯源。脉冲场凝胶电泳(PFGE)的方法已经广泛的运用到零售环节肉鸡制品沙门氏菌的分子分型,而对于肉鸡生产加工过程中的运用很少。本研究通过对屠宰场监测菌株的分子分型,初步建立了河南、江苏、四川、山东4省肉鸡屠宰加工环节的分子分型数据库,比较不同地域的优势菌株和其基因指纹图谱,有利于完善从农场到餐桌食物链中沙门氏菌污染的研究,为调查食源性疾病暴发、流行及确定和溯源病原体的传染源提供依据。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 门氏菌的分离 2010年6~11月,在河南、江苏、四川、山东的规模化屠宰场进行沙门氏菌专项调查,共分离到沙门氏菌167株,由国家食品安全风险评估中心完成菌株鉴定,血清分型,并进行保存。其中从屠宰场活体肛拭子(养殖场运输到屠宰场,进入屠宰流水线前)分离的菌株有43株(检出率为6.7%),从屠宰场胴体(屠宰流水线预冷池冷藏后)分离的菌株有124株(检出率为16.2%)。各省菌株情况见表1。 1.1.2 细胞、糖和汁 BioMérieux Vitek浊度计、恒温振荡器、GEL DOC XR凝胶成像系统、纯水仪、CHEF-mappe型脉冲场凝胶电泳仪。 脑心浸液琼脂(brain heart infusion agar,BHA)和脑心浸液肉汤(brain heart infusion broth,BHI)均购自英国Oxoid公司,Tris base和Tris-HCl(Promega,美国),蛋白酶K(Merck,德国)、限制性内切酶XbaⅠ(New England Bio Labs,美国)、C15H28NNa O3(Sodium lauroyl Sarcosine,SLS)、SDS、Na2EDTA·2H2O、血琼脂平板、比浊管、Sea Kem Gold琼脂糖。质控菌株为H9812本室保存。 1.2 方法 1.2.1 脉冲场凝胶电泳分型 参照美国疾病预防控制中心Pulse Net的统一方法,脉冲场凝胶电泳分型所用标准菌株为Salmonella Braenderup血清型全球参考菌株H9812。 1.2.2 条带位置的标定 PFGE图像应用Bio Numerics(Version 4.0)数据库软件(Applied Maths BVBA,Belium)进行处理,识别图像条带。在图像识别过程中,在Marker最小片段外的试验菌株条带因为不能为Marker校准而被舍去。图像通过统一的Marker进行校准,标定条带位置,必要时进行人工校正。 聚类方法和参数选择:聚类图类型选择UPGMA(unweighted pair group method using arithmetic averages)方法,条带位置差异容许度选择1.0%,优化值0.5%。Band based/Dice方法计算相似性系数,即Dice系数(F值×100%)。 nx:菌株x的总的片段数; nxy:菌株x和菌株y的相同的片段数。 F值反映的是不同菌株电泳条带的相似性程度,范围在0~1之间,0代表完全不相关,l代表完全相同。在限制性内切酶的作用下,不同的菌株会呈现不同的条带数和片段大小,按照PulseNet的命名原则,对每一种不同的带型进行命名。 2 结果 2.11 菌株之间的相关性 167株沙门氏菌DNA经Xba I限制性内切酶酶切后,进行脉冲场凝胶电泳,分析结果显示,167株沙门氏菌共分为18个群,包括75个不同的带型,菌株相似度为50.91%~100%。PFGE指纹图谱与血清具有一定的相关性,相同血清型的菌株聚类后,都能分到同一群。本研究获得的65株印地安纳沙门氏菌有38个带型,依次命名为JFPX01.C0001~JFPX01.C00038。54株肠炎沙门氏菌有16个带型,依次命名JEGX01.C0001~JEGX01.C0016。16株奥尔巴尼沙门氏菌有1个带型,命名为TDCX01.C0001,其他血清型依次类推(包括罗米纳沙门氏菌、斯坦利沙门氏菌、巴森海德沙门氏菌、雷摩沙门氏菌、内科拉沙门氏、菌舒卜拉沙门氏菌、维也纳沙门氏菌、胥瓦增格隆沙门菌共计8种血清型)。6株布利丹沙门氏菌有2个带型,5株哈达尔沙门氏菌有3个带型,3株山夫登