不同贮存年限陈皮甲醇提取物的hplc指纹图谱研究.docxVIP

不同贮存年限陈皮甲醇提取物的hplc指纹图谱研究 陈皮是广州植物及其栽培变体的干燥、成熟的果皮。具有理气健脾、燥湿化痰作用,临床用于胸脘胀满、食少吐泻、咳嗽痰多等症。化学成分主要有挥发油、黄酮类、生物碱等成分。黄酮类成分包括:橙皮苷、新陈皮苷、柑橘素、柚皮苷等,其中橙皮苷为主要成分。古人用橘皮主张以陈为好,药材名“陈皮”即由此而来。主张陈用的原因是陈则“烈气(挥发油)消散,减少副作用而增加疗效”,放置时间越长,其橙皮苷含量越高。对不同贮存年限的陈皮药效比较研究证明了橘皮陈用说法的合理性,有关不同贮存期的陈皮及陈皮炮制品质量比较证明陈皮放置的时间越长,其挥发油的含量越低,不同贮存期的陈皮及陈皮炮制品所含的黄酮类成分基本相同,但橙皮苷含量相差较大。关于陈皮的高效液相(HPLC)指纹图谱研究也有相关报道,但都停留于以橙皮苷为参照标准的HPLC法,对指纹图谱中化学成分没有进行结构鉴定和分析。本实验在已有研究的基础上,对贮存1,10,15,30,38和45年陈皮甲醇提取物分别进行了HPLC指纹图谱的比较分析,并用高效液相-高分辨质谱联用技术(HPLC-HRMS)对共有峰进行鉴定和指认,更进一步研究不同贮存年限对陈皮化学成分的影响,并对其黄酮类成分的质谱裂解规律进行了探索。 材料和方法 1 回转共振质谱仪 Agilent 1100 HPLC配有在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(DAD);傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(LTQ FT-ICRMS,Thermo Fisher),配有Surveyor HPLC系统。 乙腈、甲醇购于BurdickJackson公司(Muskegon,MI,USA)公司,色谱级;水为去离子水;冰醋酸购自北京化工厂,分析纯。 不同贮存年限的陈皮药材产于广东新惠。橙皮苷和柚皮苷对照品(用于含量测定)购于中国药品生物制品检定所,结构式见图1。 2 对照品储备液的制备 精密称取橙皮苷、柚皮苷对照品各1.00 mg,分别置于1 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容,即得浓度为1.00 g·L-1的对照品储备液。 陈皮药材粉碎,过40目筛,精密称取不同贮存年限的药材粉末100 mg,平行2份,置具塞玻璃试管中,分别加入5 mL甲醇,充分浸润后超声45 min,离心取上清液,过0.45μm微孔滤膜,即得陈皮药材供试品溶液。 3 冰醋酸水b 采用Hypersil DBS C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相由乙腈(A)和0.1%冰醋酸水(B)组成,采用梯度洗脱,梯度洗脱程序为:0～30 min,VA5%～25%,VB95%～75%;30～55 min,VA25%～95%,VB 75%～5%;55～60 min,VA95%,VB5%;Post Time:10 min。检测波长为284 nm;进样量为20μL;柱温为25℃;流速为0.8 mL·min-1。 4 检测波长的选择 采用二极管阵列检测器对检测波长进行了考察,分别提取并观察在230,284和340 nm波长处的色谱图,结果在284 nm处各色谱峰均有较好的紫外吸收,色谱信息最为丰富,因此,选择该波长作为检测波长。 陈皮药材所含成分复杂且极性范围跨度很大,等度洗脱很难分离,故采用梯度洗脱方式。并根据参考文献选择乙腈-0.1%醋酸水溶液为流动相。 5 检测模式的确定 ESI电离源,对甲醇提取物分别进行了正、负离子模式的扫描,结果表明正离子检测模式的信号相应强度和信息量均较好,最终选择正离子检测模式。扫描范围(m/z):100～1 500;鞘气流:35 arb,辅助气:10 arb,吹扫气:5 arb;喷雾电压:4.0 kV;毛细管温度:275℃;毛细管电压:40 V;Tube lens:90 V。 6 测定总稳定性 配制陈皮药材供试品溶液连续进样6次,进行HPLC指纹图谱分析,得到日内精密度。 配制陈皮药材供试品溶液分别在0,2,4,8,12和24 h进行HPLC指纹图谱分析,得到日内稳定性。另取此溶液每天进行测定,连续测定6 d,得到日间稳定性。 取陈皮样品粉末6份,精密称定,制备供试品溶液,进行HPLC指纹图谱分析。 以HPLC指纹图谱中主要色谱峰的峰面积和保留时间为指标考察HPLC指纹图谱方法的精密度、稳定性和重现性,结果表明精密度、稳定性和重现性考察中主要色谱峰的相对保留时间RSD均小于0.02%,峰面积RSD均小于5%,表明该方法稳定性、精密度、重复性均较好,能够满足指纹图谱分析要求。 7 指纹图谱的对照 应用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”(国家药典委员会编)软件进行数据处理,将多个色谱图进行比较,得到全面反映多个色谱图特征的共有模式色谱图-对照指纹图谱。以对照指纹图谱为基准,计算每个色谱图与之相比较的相似度。 结果