第五章亲和层析分离技术详解.pptVIP

常见的核苷酸及辅酶亲和层析介质 配基分类 配基 生产公司 典型应用 腺苷 腺苷3’，5’－环化单磷酸（CAMP） PL Biochemical SIGMA 腺苷激酶及脱氨酸 腺苷－3’，5’二磷酸（3’，5’－ADP） PL Biochemical SIGMA Pharmcia 依赖辅酶A的酶 腺苷－5’－单磷酸（AMP） PL Biochemical 磷酸化酶 腺苷－5’－三磷酸（AIP） PL Biochemical 激酶 辅酶 辅酶A（CoA） PL Biochemical CoA转移酶， 乙酸-CoA酶 氧化型辅酶I（NAD＋） PL Biochemical SIGMA 5-核苷酸酶 氧化型辅酶Ⅱ（NADP＋） PL Biochemical 核酸酶 核苷酸 鸟苷-5’-三磷酸 SIGMA 谷氨酸脱氢酶 核苷酸及辅酶亲和层析 本文档共43页；当前第30页；编辑于星期六\11点19分 N6（6-氨己基）氨甲酰-AMP-Sepharose间接偶联法示意图 核苷酸及辅酶亲和层析 本文档共43页；当前第31页；编辑于星期六\11点19分 第五章亲和层析分离技术详解演示文稿 本文档共43页；当前第1页；编辑于星期六\11点19分 优选第五章亲和层析分离技术 本文档共43页；当前第2页；编辑于星期六\11点19分 利用生物大分子之间的专一性识别性或特定的相互作用的分离技术称为亲和层析分离技术 5.1 简介 本文档共43页；当前第3页；编辑于星期六\11点19分 简介——亲和配基 单专一性的小分子配基 基团专一性小分子亲和配基 专一性的大分子亲和配基 免疫亲和配基 基因专一性的大分子亲和配基 本文档共43页；当前第4页；编辑于星期六\11点19分 参数 生物专一性（AC） 拟生物专一性配基亲和层析 IMAC DLAC HLAC 专一性 很高 较高 中等 较高， 取决于吸附条件 配基交联技术 很多 环氧化物 直接吸附或 对氧化物 解吸难易 中等 容易 化学 交联容易 容易 吸附容量 低，0.1-1.0%配基利用 高 高 中等 再生及稳定性 较差，易变性 高 高 高，可用浓或处理 成本 高 较低 最低 较低 不同亲和层析分离方法的比较 本文档共43页；当前第5页；编辑于星期六\11点19分 简介——亲和洗脱 亲和洗脱是和亲和吸附（Affinity Adsorption）对应的，即利用在洗脱液中加入和吸附目标蛋白有专一性的物质，而只将目标分子解吸下来。亲和洗脱可用于亲和层吸，也可以用于普通的层析如离子交换等的解吸。亲和洗脱一般采用和目标分子具有识别性的小分子或类似物。 本文档共43页；当前第6页；编辑于星期六\11点19分 亲和层析分离技术 亲和层析的理论 亲和介质的制备 常见的亲和层析 本文档共43页；当前第7页；编辑于星期六\11点19分 5.2 亲和层析的理论 当蛋白质在非凝胶相和凝胶相之间达到平衡 本文档共43页；当前第8页；编辑于星期六\11点19分 亲和层析的理论 对正常的凝胶过滤色谱而言 亲和色谱中，固定配基在蛋白和凝胶之间产生的额外亲和作用 本文档共43页；当前第9页；编辑于星期六\11点19分 亲和层析的理论 本文档共43页；当前第10页；编辑于星期六\11点19分 实际上，Ve’/Ve很难测定，但在洗脱液中，加入可活性配基或竞争性抑制剂，使固定配基的表边的亲和力降低，其数值可以测得 亲和层析的理论 本文档共43页；当前第11页；编辑于星期六\11点19分 推导得到 在可溶性亲和竞争性配基的存在下，固定配基对酶的阻滞作用降低，其程度取决于可溶性配基和固定配基的相对浓度和解离常数。 亲和层析的理论 本文档共43页；当前第12页；编辑于星期六\11点19分 5.3 亲和介质的制备 介质的选择 介质的活化和偶联 亲和配基固定偶联的密度的测定 间臂分子的选择 本文档共43页；当前第13页；编辑于星期六\11点19分 介质的选择 通常而言，亲和色谱的介质应具备下面四个条件： 具有多孔网络结构 非特异吸附小，基质化学性质应是惰性，表面 电荷尽可能低； 理化性质稳定，不因共价偶联反应的条件及吸 附条件的变化而发生变化； 基质必须能够活化或功能化 介质是亲和配基附着的基础，起着支撑和骨架作用 本文档共43页；当前第14页；编辑于星期六\11点19分 介质的选择 多糖类： 纤维素（cellulose）、葡聚糖（dextrin） 琼脂糖（agarose） 聚丙烯酰胺 无机基质 可控制孔径多孔玻璃（CPG）、 陶瓷和硅胶 本文档共43页；当前