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人工心瓣内膜炎细菌对细菌的粘结能力测定 术后人工瓣膜交换后，人工瓣膜心内膜炎（pve）常是瓣膜交换患者的灾难结果。近来很多国外研究表明:这种生物材料植入后引起机体感染的初始动因就是细菌粘附在生物材料表面,国内对这方面研究尚属空白。人工心瓣无论是机械心瓣膜或生物心瓣膜都是多种生物材料的复合体,是哪种材料易引起细菌粘附,细菌对不同人工心瓣材料的动态粘附情况,迄今尚未见报道。本研究的目的在于通过体外实验,评价PVE常见致病菌对人工心脏瓣膜材料的体外粘附情况,初步建立人工心瓣材料细菌粘附的测定方法,并为在人工心瓣材料表面进行改性,提高生物材料的抗细菌粘附能力奠定工作基础。 1 材料和方法 1.1 高分子材料 涤纶(Dacron,D)苏州织带厂人造血管研究室;聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethylene,PTFE)Teflon-GoreTex W.L. Gore Associates, Inc. Arizona美国;热解碳片(Pyrolytic Carbon, PC):四川大学高分子材料系。将三种材料制成面积1.5 cm2半园型,厚度0.5 mm,高温消毒。 1.2 细菌和标准株 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA) 大肠杆菌(Escherichia coli, EC) 表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis, SE) 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)所有细菌为标准株 1.31 细菌菌液浓度和与放射性强度的关系 取斜面保种的细菌种植在液体培养基中,37 ℃恒温培养16 h。接种于平板培养基,培养24 h,取单个菌落于液体培养基中37 ℃培养24 h,得到菌液。小鼠毒力回复实验与其标准比较,无统计学差异。取9.9 ml液体培养基加0.1 ml菌液,再加入10 μl 5-125I-2′-脱氧尿嘧啶核苷(125I-UDR,中国科学院原子能研究院),37 ℃培养6 h。将菌液离心,除去上清液,加入生理盐水,旋涡混合器中振荡,使沉淀后的细菌再悬浮于生理盐水中,重复三次,去除未标记细菌的125I-UDR。采用平板计数法测定菌液的细菌浓度,γ-射线计数法测定放射性强度。根据菌液稀释倍数,放射性强度的测定值,推算出125I标记的细菌菌液浓度及与放射性强度的关系,稀释成实验所需的浓度。制成5种细菌悬液。 1.4 细菌耐碱及放射性强度测定 按液体培养基2 ml加125I-UDR 1 μl比例加入125I-UDR和液体培养基入消毒锥形瓶中,锥形瓶编号:1、2、3和4号,在1、2、3号锥形瓶中加入125I标记的同一种细菌菌液各2 ml(已稀释成105CFU/ml)。在1号锥形瓶放入热解碳,2号放入涤纶,3号放聚四氟乙烯,4号放入热解碳、涤纶、聚四氟乙烯。将锥形瓶放入36.8~37.0 ℃水浴摇床振摇培养30 h,间隔2 h在每个锥形瓶中取定量的菌液测定细菌浓度。 同时取定量的菌液离心,除去上清液,再加生理盐水,旋涡混合器振荡,使沉淀细菌悬浮于生理盐水中,去除未标记细菌的125I-UDR,测定放射性强度。取各时点细菌浓度,放射性强度得到细菌的生长曲线与放射性强度的关系。 1.5 放射性强度测定 从测定细菌生长曲线所用的锥形瓶1、2、3号中分别在0、6、12、18、24、30 h等时点各取出材料4片,4号锥形瓶在每个等时点取出热解碳、涤纶、聚四氟乙烯各1片。所有锥形瓶取出的材料,每片用20 ml PBS液冲洗材料2次,去除未粘附的细菌和附着在材料上游离的125I-UDR,测定材料的放射性强度。因4号锥形瓶未放细菌,热解碳、涤纶、聚四氟乙烯经冲洗后测得的放射性强度,是未被冲洗掉游离的125I-UDR,在计算1、2、3号锥形瓶中热解碳、涤纶、聚四氟乙烯的放射性强度时,应减去相同时点所测得的4号锥形瓶相同其材料的放射性强度。根据生长曲线将其换算成细菌数,除以材料面积得到CFU/cm2。 1.6 统计处理 两因素或多因素的方差分析,Logrank检验法α=0.05为检验水准。所有细菌数在制图时换算成细菌数的对数。 2 细菌内容的黏合性 图1为细菌的生长曲线。 从图2看出四种细菌对涤纶的粘附情况。金葡、大肠杆菌持续在比较高水平。而且金葡粘附不随生长曲线进入衰亡期而减少,与其它三种细菌比较,差异有非常显著性(P0.01)。图3看出表皮葡萄球菌对热解碳的粘附最强,在高峰期与其它三种细菌差异有显著性(P0.05)。但绿脓杆菌对其粘附维持在持续高水平状态,未见到随生长曲线进入衰退期有下降的趋势(P0.01)。图4看出大肠杆菌、绿脓杆菌对聚四氟乙烯的粘附最强,与金葡菌、表葡菌对其粘附差异有非常显著性(P0.01)。 从以上研究结果显示细菌对材料的粘附与细菌生长曲线关系密切,粘附