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产氢细菌的分离鉴定及产氢能力的研究 氢能被称为未来的“清洁能源”。它本身可再生, 燃烧时只产生水, 而不产生热和污染物, 可实现真正的“零”排放。同时, 氢以水的形式大量存在于地球上, 储量十分丰富。能量密度是汽油的2.75倍高, 热转化率也很高。氢的制备包括化石燃料制氢、电解水制氢和生物质制氢等方式。生物制氢主要包括光合生物制氢和发酵细菌制氢。前两种方式要消耗大量的电能及天然气、煤和石油等化工燃料。因此, 后者更有工程实践的价值。其中发酵产氢速度快, 反应器设计简单, 且能够利用可再生资源和废弃有机物进行生产, 相对于光合产氢更容易在短期内实现。 与此同时, 在污水处理中产生的大量剩余污泥, 如果不做无害化处理, 会给环境带来污染。目前常用的污泥处理方法有焚烧法、填埋法、土地利用等方法, 但这些方法都对生态环境和人类健康具有长期潜在的危害性。合理地处置、处理、资源化利用污泥, 已经成为城市经济发展和可持续性发展的一个重大问题。 1 材料和方法 1.1 培养基g/l 种泥分别来自厦门市污水处理厂厌氧污泥、长沙市第二污水处理厂的好氧污泥及长沙市湘江河底泥;纯种菌为笔者培养筛选出的产氢菌属Enterococcus sp.LG1。 液体培养基 (g/L) :葡萄糖20.0, 胰蛋白胨1.0, 蛋白胨3.0, 牛肉膏2.0, 酵母汁1.0, Na Cl 3.0, K2HPO41.0, 2-半胱氨酸0.5, 微量元素和维生素 (抗坏血酸0.025, 叶酸0.01, Ni Cl2·6H2O 0.001, Ca Cl2·2H2O 0.01, Zn Cl20.02) 各10.0 m L/L, 刃天青 (0.2%) 1 m L;p H 6.0。 固体培养基 (g/L) :琼脂20~25, 其他成分同液体培养基。 实验用的污泥取自长沙市第一污水厂剩余污泥污泥性质如表1所示。 1.2 挥发性酸测定方法 污泥厌氧发酵过程中产生的气体体积采用定期排饱和食盐水法进行测定。用1 m L气密性注射器取气体样, 气体样含量采用气相色谱法 (安捷伦6890N色谱分析仪, TCD检测器) 测定。用10 m L注射器对反应瓶中的污泥进行取样。测定污泥的挥发性酸VFA (安捷伦6890N色谱分析仪, FID检测器) p H值 (WTW muti340i p H计) ;蛋白质、总糖浓度总化学需氧量 (TCOD) 和可溶解性化学需氧量 (SCOD) :标准重铬酸钾法。 1.3 实验方法 1.3.1 产氢菌株的分离和纯化 分别取厦门市污水处理厂厌氧污泥、长沙市第二污水处理厂的好氧污泥及长沙市湘江河底泥, 按下述的提纯方法进行纯化处理, 共分离得到产氢菌12株。将其分别接种于剩余物泥中, 测其产氢效果, 得到一株高效产氢菌Enterococcus sp.LG1。 细菌提纯程序: (1) 在80℃温度下热预处理2 h, 以降低产CH4菌的生物活性; (2) 用已灭菌的器皿将颗粒污泥捣碎; (3) 利用Hungate滚管技术对已接种的污泥进行产氢菌的分离和纯化, 先在固体培养基上培养, 然后把菌落接种于液体培养基中, 再取1 m L菌液, 稀释106倍, 再接到固体培养基中, 重复3次; (4) 测定3次提纯细菌的产氢量, 选择产氢效果最好的菌株。 1.3.2 pcr扩增和纯化 菌种的鉴定通过以下步骤: (1) DNA提取; (2) 电泳检查DNA; (3) 16S r DNA的PCR扩增; (4) 序列测定。 16S r DNA的PCR扩增方法:正向引物BSF8/20:5′-AG A GTT TGA T C C T G GC T C A G-3′, 反向引物PLA:5′-GGTACTTAGATGTTTCAGTTC-3′, 分别对应于E.coli 16S r RNA的8~27和23S r RNA的209~189位。测序由上海博亚生物技术有限公司完成。PCR扩增采用PTC-100热循环仪 (美国MJ公司) 。反应体系100μL:10×buffer (10μL) ;引物BSF8/203μL (0.6μmol) ;引物PLA 3μL (0.6μmol) ;d NTP8μL (200μmol) ;Taq酶0.5μL (5 U/μL) ;模板1μL (0.05μg/μL) ~1.0μg/μL) ;双脱氧水74.5μL。反应程序为94℃4 min;94℃1.5 min, 55℃1 min;72℃1.5 min, 30个循环;72℃10min。采用低熔点琼脂糖的方法切胶回收目的片段, 并电泳检测PCR产物的纯化。 测定结果显示本实验中的菌种是肠球型产氢菌属Enterococcus sp.LG1, 其16S r DNA序列在Gen Bank中的注册号为EU258743。 1.3.3 反应瓶和s