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原代肝细胞培养技术的研究进展 肝脏是生理和病理状态下药物代谢的重要器官。肝脏代谢后，许多内部和外部因素对生物体的毒性作用被消除。作为这个生物转化过程的重要发生器官,肝脏就必然成为药物研究中的重要靶器官。研究者们常采用一系列体外的方法研究药物的代谢情况及代谢机制,药物相互作用,如肝微粒体,原代肝细胞,肝脏灌流,肝组织切片,基因工程细胞模型和纯化酶制剂等。在这些体外研究中原代肝细胞具有较好的体外实验重现性,基本维持了肝脏的代谢功能,特别是很好的保留了与体内一致的细胞色素P450酶的水平。作为研究工具,可在细胞水平上提供吸收、代谢、转运等综合信息, 为药物安全性评价,临床合理用药等提供了重要和理想的体外模型和有效体外分析手段,目前成为体外药物实验的“金标准”,广泛应用于药物代谢和毒理学研究中。 1 人肝脏前培养 肝细胞的分离、培养是体外研究肝脏和肝细胞的必要条件。原代肝细胞在体外是否成活,消化分离技术是一大难题。目前应用最为广泛的是Seglen的“二步灌流法”,因其在胶原酶消化细胞前使用了螯合剂,进一步提高了肝细胞产量和活力。 “二步灌流法”制备大鼠原代肝细胞的基本方法如下:常规麻醉及皮肤消毒后开腹,门静脉插管并固定,剪断下腔静脉同时灌流无钙含EDTA 的前灌流液, 反复灌注以洗尽肝脏中的积血;待肝脏表面呈现黄色后,用D-Hanks液洗尽肝中的EDTA;再用含钙的0.05%胶原酶缓冲液灌注肝脏20～30 min;撕开肝脏包膜使肝细胞脱落下来,经200目滤网过滤;50 g·min-1,离心3 min,清洗2次,用培养基重悬可得细胞悬液,常被选用的培养基有RPMI-1640,Williams medium E液,DMEM-F12和Hams F12液等。整个过程最重要的是清洗干净肝脏内的血和对肝细胞悬液的离心清洗。 在新药研发过程中,常常会遇到不同种属之间,药物的代谢速度,代谢途径有较大差别,因此不能用动物的代谢情况等来预测人的情况,利用人肝细胞无疑较其他细胞更具说服力。近几年来许多的研究者致力于人原代肝细胞的分离消化技术,如今在成年大鼠在体获得肝细胞的“二步灌流法”已经用于离体的处理人肝组织消化分离人肝细胞,并且得到不断的改进。不同之处是用于培养的人肝组织只有一部分,因而只能对肝组织上残存的血管进行灌注,并且必须在离体后尽快进行灌注,以免肝细胞活性降低。肝组织最好在50～400 g,太大会引起胶原酶消化不完全;原发性肿瘤、转移瘤、腺瘤及血管瘤手术切除的肝组织中的正常部分可用于原代培养,出现大面积脂肪变性和硬化的肝组织是不适合用于原代培养的。其技术依然面临许多的困难,如:正常肝组织的不易获得;由于不能进行全肝灌流,无法洗干净组织内的血,影响细胞分离和生长等。 由于肝细胞属于高分化的细胞,对体外培养环境的要求比普通细胞高,为了肝细胞能很好的保持其生物活性,需要加入各种复杂的培养基质和添加物。应用细胞外基质(extracellular matrix, ECM) 作为辅助成分可促进细胞在体外的黏附和增殖,这种方法已广泛用于细胞培养。常用的基质成分包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、和Ⅴ型胶原,层粘连蛋白1 、肌腱蛋白、血小板反应蛋白和玻连蛋白等,大多数学者采用胶原作为原代肝细胞培养的细胞外基质,并发展了“三明治夹心”培养法,即把细胞放在两层胶原中进行培养,更有效的维持了肝细胞的各种特性;添加物可加入胰岛素、地塞米松、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和丙酮酸盐等,更好维持了肝细胞的代谢能力和适应能力。 肝细胞被分离后,可进行贴壁培养和悬浮培养,新鲜分离的悬浮细胞在12 h内很好的维持了细胞色素P450酶的活性,并且在最开始的4 h内最为与体内一致,随时间的延长而迅速下降;而贴壁细胞有足够的时间从损伤中恢复过来,具有正常细胞的形态特征。随着技术水平的提高,现在已建立了长期冻存肝细胞的方法。现在已有许多国外公司为研究者提供各种种属的原代肝细胞,国内目前上海瑞德肝病研究所也能为研究者提供这种服务。 2 药物与肝、肝相互作用 随着技术水平的不断提高,原代培养大鼠和人肝细胞已广泛用于药物研究,如探讨药物在肝中的代谢途径和药物药代动力学的研究;评价药物和外源性物质对肝微粒体中细胞色素P450酶诱导作用并探讨其诱导机制;预测和解释药物与药物之间的相互作用;研究药物的细胞毒性等。 2.1 中草药对cyp3a4基因表达的调节作用 原代肝细胞培养为药物生物转化途径的研究,寻找药物可能的代谢物提供了一个简单和有效的模型。通过药物和原代肝细胞的孵育,可以得到相对多量和高纯度的代谢物,减少了许多外界因素的干扰,特别是人原代肝细胞已成为最接近在体肝脏研究药物代谢的体系。Monostory等利用新鲜分离的小鼠、大鼠、兔子、狗和人的原代肝细胞研究德伦环烷