培训一各种引物设计.pptVIP

* 培训大纲 一 引物设计 1. 普通基因或者片段扩增引物 2. 荧光定量PCR引物 3. 适用于酶切载体构建和Gateway载体构建的引物设计 4. RNAi载体构建的引物 5. 亚细胞定位的载体构建 二 基因克隆 1.普通PCR 2.长片段及短片段克隆 3.平末端，黏性末端克隆 三 TA克隆，E coil转化 四 质粒提取 五 载体构建 1.酶切载体构建及验证 2.Gateway载体构建及验证 3.农杆菌转化（发根，根癌） 六 转基因及功能验证 七 苜蓿毛状根转化 八 菌根染色观察，显微镜使用 本文档共27页；当前第1页；编辑于星期日\12点5分 基因定义 基因组DNA cDNA RNA提取 本文档共27页；当前第2页；编辑于星期日\12点5分 1.家族基因。 是指具有相同功能的，不同基因。 2.转录本。 是指一个基因有两个不同的转录结果。都来自于一个基因，由于选择性剪切导致的。 本文档共27页；当前第3页；编辑于星期日\12点5分 基因扩增PCR 体系：酶，缓冲液Buffer, dNTP,MgCl2,引物F，R。Forward, Re F引物 R引物 本文档共27页；当前第4页；编辑于星期日\12点5分 流程 1.模板准备，引物准备 2.PCR扩增 3.片段回收 4.连接TA克隆 5.转化大肠杆菌 6.测序，确定序列 7.提质粒，保存菌液（15%-30%甘油） 本文档共27页；当前第5页；编辑于星期日\12点5分 序列寻找 参考基因组网站：甜橙（Citrus sinensis）。 柑橘菌根模式：枳壳（Poncirus trif.），做为砧木，使用范围最广，抗寒。 苜蓿基因组： /cgi-bin/medicago/overview.cgi。 基因研究情况。 本文档共27页；当前第6页；编辑于星期日\12点5分 1.枳壳中基因，做亚细胞定位 克隆启动子（用DNA）ATG前2kb，基因序列（用RNA反转录的cDNA）。 2.对应到苜蓿中基因，做RNAi功能验证，荧光定量PCR验证。（用cDNA克隆） 本文档共27页；当前第7页；编辑于星期日\12点5分 引物设计原则 1、长度：15—30bp，其有效长度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。 2、G十c含量：应在40%一60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。 3. Tm 53-60 3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。 4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。 5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。 6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。 7、3’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C。 8、引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。 示范。。。最普通的PCR引物设计。。。 本文档共27页；当前第8页；编辑于星期日\12点5分 本文档共27页；当前第9页；编辑于星期日\12点5分 荧光定量PCR引物设计 1.Tm 60度。 2.片段特异性。在基因组上，仅存在这一条片段，只能扩出这一条片段。选取3‘UTR区域。 3.片段长度在60-100bp左右。 本文档共27页；当前第10页；编辑于星期日\12点5分 酶切法构建载体 本文档共27页；当前第11页；编辑于星期日\12点5分 1.选择载体上的酶切位点。保证所需要的基因片段中不包含此酶切位点。 2.添加酶切位点和保护碱基。都添加到引物的5’端。 本文档共27页；当前第12页；编辑于星期日\12点5分 Topo克隆 本文档共27页；当前第13页；编辑于星期日\12点5分 本文档共27页；当前第14页；编辑于星期日\12点5分 本文档共27页；当前第15页；编辑于星期日\12点5分 本文档共27页；当前第16页；编辑于星期日\12点5分 Gateway反应 本文档共27页；当前第17页；编辑于星期日\12点5分 本文档共27页；当前第18页；编辑于星期日\12点5分 RNAi 本文档共27页；当前第19页；编辑于星期日\12点5分 *