壳斗科植物单宁和安石榴苷抗酪氨酸酶及抗黑色素生成机制研究.pdf

摘要

黑色素的异常累积会诱发色素沉着性皮肤疾病，并且会增加个体患恶性黑

色素瘤的风险。酪氨酸酶作为黑色素生物合成途径中的限速酶，也是调节黑色

素生成的重要靶点。酪氨酸抑制剂可通过抑制酶的活性而起到色素沉着性皮肤

疾病治疗、美白、果蔬保鲜等作用，其具有应用于医药、农业、食品等领域的

潜能。本论文以壳斗科植物单宁和安石榴苷为研究对象，探讨其对酪氨酸酶活

性和黑色素生成的抑制作用及机制。主要的研究内容及结果如下：

1.本论文采用有机溶剂萃取和柱层析相结合的方法，从不同壳斗科植物的

果壳和果仁干粉中分离获得赤皮青丙果壳单宁(QGST)、青丙果壳单宁(TST)、

青冈果仁单宁(TNT)、青冈栎果壳单宁(CGST)、刺栲果壳单宁(CHST)和楣公栲

果壳单宁(CMST)6种单宁。使用醇解/酸解结合HPLC的方法对其结构进行了鉴

定，结果发现TNT、CGST、CHST、CMST主要是以鞣花单宁为主的水解单宁;

而QGST主要是由原花青定、原翠雀定聚合而成的缩合单宁，TST主要是由原

花青定聚合而成的缩合单宁。

2.本论文以蘑菇酪氨酸酶为活性分靶点，通过酶学实验发现这6种壳斗

科植物单宁均表现出高效的酪氨酸酶抑制活性，其IC5o值分别为54.09±0.04

|xg/mL(QGST),73.11±0.03|xg/mL(CMST),100.2±0.05|xg/mL(TNT),100.6±0.08

|xg/mL(CHST),115.4±0.05|xg/mL(CGST),127.9±0.04|xg/mL(CGST),抑制效果

均强于阳性对照熊果苷ac5Q=149Mg/mL)。酶动力学分发现6种壳斗科植物

单宁通过与酪氨酸酶氨基酸残基形成非共价键可逆性地抑制酶的活性，并且它

们被证实为混合型抑制剂，其幻值小于Xis值表明这些壳斗科植物单宁聚合物

更易与游离酶相结合来抑制酶的活性。

3.本论文联合使用多种荧光光谱学方法结合分子对接技术研究壳斗科植物

单宁抑制酪氨酸酶的作用机制。荧光淬灭和分子对接结果表明这6种壳斗科植

物单宁在氢键、范德华力、疏水作用等非共价作用力的驱动下与酪氨酸酶结合

形成基态复合物，从而静态地淬灭酪氨酸酶荧光。同步荧光结果表明QGST和

TST两种缩合单宁能够改变酪氨酸酶发色团（酪氨酸和色氨酸残基）周围的疏

水性和微环境极性，CGST和CHST只影响酪氨酸残基周围的微环境变化，而

CMST和TNT则对酶发色团疏水性和微环境无明显影响。三维荧光光谱结果证

实这6种壳斗科植物单宁能够与酪氨酸酶结合导致其蛋白骨架的延展，从而造

成酶构象的变化。

4.本论文使用CCK8法、多巴氧化法、NaOH裂解法和ROS含量测定法综

合研究了QGST的抗黑色素生成和抗氧化活性。结果显示当浓度小于25iig/mL

时，QGST不会影响B16F10小鼠黑色素瘤细胞的增殖活力。在黑色素生成方面，

QGST不仅可以通过抑制细胞内酪氨酸酶的活性来直接抑制黑色素生成，也可

以通过高效地清除细胞内的活性氧自由基来间接抑制黑色素生成。

5.本论文也以安石榴苷（一种水解单宁）为实验对象，研究其抗酪氨酸酶

和抗黑色素生成的机制。酶学实验结果表明安石榴苷在体外(IC5o=0.64±0.05mM)

和细胞内(IC50=16±0.7pM)均显著抑制酪氨酸酶的活性。分子动力学分表明安

石榴苷与酪氨酸酶的结合松弛了酶的蛋白骨架结构，降低了酶的表面疏水性。

细胞实验进一步表明，安石榴苷通过下调细胞内MITF转录因子和酪氨酸酶蛋

白的表达来抑制黑色素生成。

综上所述，无论是壳斗科植物单宁的多聚物，还是安石榴苷（水解单宁的

小分子化合物)，均为高效的酪氨酸酶抑制剂，它们均有望进一步开发成色素沉

着性皮肤疾病治疗药物。

关键词：黑色素；酪氨酸酶；壳斗科植物；单宁；抑制机制；安石榴苷