高效液相色谱法同时测定茯苓药材中去氢茯苓酸和茯苓酸的含量.docxVIP

高效液相色谱法同时测定茯苓药材中去氢茯苓酸和茯苓酸的含量

椰子是多孔菌科的一种干燥菌核。它尝起来又甜又平。归心、肺、脾、肾经,具有利水渗湿、健脾宁心之功效。主要用于水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、便溏泄泻、心神不安、惊悸失眠等症。茯苓中主要含有茯苓聚糖、四环三萜酸(统称为茯苓素)以及脂肪酸等。有研究表明,茯苓素对艾氏腹水瘤、肉瘤S180、白血病L1210细胞有显著抑制作用,对小鼠Lewis肺癌的转移也有一定作用,与环磷酰胺等抗癌药合用有一定的协同作用及免疫增强作用等。其中茯苓酸、土莫酸、去氢土莫酸与去氢茯苓酸等均为茯苓素中活性成分,作者所在的课题组曾对茯苓中去氢土莫酸进行了深入的研究,本文作者继续对茯苓药材中另外2种主要活性成分去氢茯苓酸和茯苓酸(结构式见图1)进行了研究,采用HPLC法同时测定其在茯苓药材中的含量,方法具有可操作性,可为茯苓的多指标质量控制标准奠定基础。

1在线色谱处理

高效液相色谱仪(LC-10ATvp输液泵,SPD-10Avp可变波长紫外检测器,HT-130柱温箱,ANASTAR色谱数据处理系统,日本Shimadzu公司)。

甲醇和乙腈为色谱纯,水为二次蒸馏水,磷酸为分析纯,去氢茯苓酸和茯苓酸对照品由实验室自制,经峰面积归一化法计算纯度质量分数均大于99.0%。

茯苓药材购自辽宁省浩天医药有限责任公司,经沈阳药科大学中药学院孙启时教授鉴定为真菌茯苓菌[Poriacocos(Schw.)Wolf.]的干燥菌核。

2方法和结果

2.1理论板数及设备

色谱柱:PhenomenexC18柱(250mm×4.6mm,4μm),流动相:乙腈-质量分数为0.1%的磷酸溶液(体积比为75∶25),流速:1.0mL·min-1,柱温:30℃,检测波长:210nm,进样量:10μL。去氢茯苓酸和茯苓酸峰的保留时间分别为22.6min和26.2min,各峰与相邻峰的分离度均大于1.5,理论板数按茯苓酸峰计算不低于3000。典型色谱图见图2。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照溶液

取去氢茯苓酸和茯苓酸对照品适量,精密称定,置于同一10mL量瓶中,加氯仿-甲醇(体积比为1∶1)溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,得到混合对照溶液(含去氢茯苓酸1.02g·L-1和茯苓酸0.72g·L-1)。精密量取该混合对照溶液1.0mL,置10mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,得到对照溶液。

2.2.2超声处理ml

取茯苓药材粗粉约2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇10mL,超声处理(功率250W,频率33kHz)30min,滤过,滤液蒸干。残渣加水溶解,用乙酸乙酯萃取2次,每次10mL,合并乙酸乙酯层,蒸干,残渣用甲醇溶解定容至10mL量瓶中,摇匀,滤过,即得。

2.3方法研究

2.3.1标准曲线的绘制

精密量取混合对照溶液0.2、0.4、1.0、2.0、3.0、4.0mL,分别置于10mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,得到系列标准溶液。依次进样10μL,以标准溶液的质量浓度(ρ/mg·L-1)为横坐标,色谱峰面积(A)为纵坐标,绘制标准曲线,得去氢茯苓酸和茯苓酸回归方程分别为A=2.094×103ρ-6.238×103(r=1.0000)和A=3.243×103ρ-9.82×103(r=1.0000),去氢茯苓酸和茯苓酸分别在20.4~408.0mg·L-1和14.4~288.0mg·L-1内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.3.2仪器精密度试验

精密吸取同一供试溶液10μL,重复进样6次,记录色谱图,去氢茯苓酸和茯苓酸峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为1.6%和1.1%,表明仪器精密度良好。

2.3.3重复性试验

取茯苓样品(No.6)适量,按“2.2.2”条下方法平行制备6份供试溶液,测定含量,去氢茯苓酸和茯苓酸的平均含量质量分数(按生药计)分别为5.12×10-2%和3.65×10-2%,其RSD分别为2.0%和1.9%,表明方法重复性良好。

2.3.4稳定性试验

取新制备的同一份供试溶液,分别在室温放置0、2、4、6、8、12h后进样,记录色谱图,测得去氢茯苓酸和茯苓酸峰面积RSD分别为1.2%和1.6%(n=6),结果表明供试溶液在12h内稳定。

2.3.5加样回收率试验

称取已知含量的茯苓样品(No.6)9份,每份1.0g,精密称定,分别精密加入混合对照溶液0.25、0.50、0.75mL,每个样品平行操作3份,按“2.2.2”条下的方法操作,在上述色谱条件下进行分析,计算去氢茯苓酸和茯苓酸的回收率,结果见表1。

2.4茯苓酸和去氢茯苓酸含量测定

取不同批次的同一产地茯苓药材粗粉,按“2.2.2”条下的方法操作,取供试