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抗白叶枯病多基因聚合品系的选育及应用

白叶枯病是水稻生产中最严重的细菌疾病之一。抗白叶枯病的选择是预防和治疗这种疾病的重要手段。剪叶接种法作为白叶枯病表现型抗性鉴定的有效方法在水稻育种中已得到广泛应用。而近年来随着生物技术的发展,水稻白叶枯病分子标记选育逐渐得到应用,国际水稻研究所运用分子标记选育方法在上世纪90年代选育出了以IR24为遗传背景的多基因聚合抗白叶枯病近等基因系,水稻品种对白叶枯病的抗性有很大提高,此后国内许多研究机构利用分子标记辅助选择选育抗白叶枯病水稻品种获得成功,抗白叶枯病分子标记检测技术进一步完善,并得到广泛应用。为分析比较常规表型抗性鉴定与分子标记检测方法的特点,近年来我们利用IRRI抗白叶枯病近等基因系为亲本对选育的恢复系进行了改造,建立了不同世代的育种群体,运用分子标记检测选种材料中白叶枯病抗性基因Xa21的存在与否,同时用剪叶接种方法对选种材料的抗性表现型进行鉴定,并对结果作比较,为进一步开展抗白叶枯病品种选育提供科学依据。

1材料和方法

1.1抗白叶枯病基因

以本课题组选育的适应本地生态环境的三系恢复系为主体亲本,其中,g71,g94和g95为籼稻恢复系,g96和g145为粳稻恢复系,这些材料对白叶枯病的抗性为感至中感。以IRRI提供的抗白叶枯病恢复系IRBB52,IRBB54,IRBB57,IRBB58,IRBB59和IRBB60为抗性供体亲本,它们携带的抗白叶枯病基因见表1。主体亲本与供体亲本杂交后,以主体亲本为轮回亲本回交1至2次,获得B1F1,F2,F3,B1F4和B2F3等不同世代的试验材料,供抗性表型鉴定和分子标记检测。

1.2iii号菌株的养殖管理

采用剪叶接种法。孕穗期剪叶接种,菌株为浙江省致病力强的IV号菌株,由浙江省农科院植保所提供。接种20d后考查发病情况,按照我国白叶枯病抗性分级标准考查。

1.3pt249与ss1的遗传距离

应用于检测Xa21的标记为pTA248,其正向和反向引物均含24个碱基对,其序列分别为5’-AGACGCGGAAGGGTGGTTCCCGGA-3’和5’-AGACGCGGTAATCGAAAGATGAAA-3’,pTA248与Xa21的遗传距离小于1cM。PCR扩增反应总体积为10μL,含10mmol/LTris-HClpH9.0,10mmol/L(NH4)2SO4,10mmol/LKCl,2.0mmol/LMgCl2,0.1%TritonX-100,0.2mmol/LdNTPs,顺反引物各33ng,Taq酶0.5U,模板DNA50ng,扩增反应程序、电泳、染色及记录方法参照曹立勇等的方法。2003年8月初在宁波定株采集叶片于取样管中置于装有冰块的泡沫箱中冷藏到中国水稻研究所抽提DNA,2003年12月下旬在中国水稻研究所进行Xa21基因的标记检测。

2结果与分析

2.1抗感分离现象

亲本材料的白叶枯病接种鉴定结果(表2)表明,受体亲本的抗性反应为2～4级,而抗性基因供体亲本除IRBB21为3级外其余均为1级。杂交或回交后代中在B1F1,F2,F3,B2F3及B1F4中均存在着抗性分离现象。而对部分F2代群体的抗性分离比例统计结果(表3)表明,接种检测的2个F2代群体都有抗感分离,都能从中选到高抗或抗白叶枯病的材料。两个群体中抗感植株占受检总植株的比例有差异,03-962(g71/IRBB60)群体中1级和2级植株所占比例达到66%,而03-963(g71/IRBB54)群体中1级和2级所占比例仅为46%,说明不同的白叶枯病抗性基因供体亲本的抗性改造效果有区别。以IRBB60作为抗性基因供体效果较好,这可能与IRBB60所含的抗性基因数较多有关。

2.2dna的扩增、扩增和分子标记的确定

应用pTA248检测亲本材料和杂交回交后代材料的Xa21基因,检测结果表明,不同的Xa21基因供体IRBB54,IRBB57,IRBB58,IRBB59和IRBB60(由于未抽提到DNA,IRBB52缺带)具有同一条带(PCR扩增产物长度约为1000bp),而主体亲本扩增产物长度均较小(650～750bp)(图1)。在经杂交改造的B1F1,F2,F3,B2F3和B1F4群体的材料中出现了Xa21纯合、杂合或不含Xa213种情况的分离。需要指出的是,所有材料在2003年之前均未进行过抗性表型检测或分子标记检测,部分材料筛选有一定的盲目性。如能在低世代剪叶接种筛选抗性表现型,将会提高白叶枯病抗性材料筛选的准确性和检测到抗性基因的可能性。

2.3标记检测结果

在本试验中,同时应用于标记检测和表型鉴定的材料共有125份,根据两种方法鉴定结果之间的关系,可将这些材料分为4种类型。第一类,标记检测表明携带Xa21