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土荆皮及其混伪品的is2序列比较研究

土荆皮又称土槿皮、松柏皮和土荆皮，最早出现在素描中。本品为松科植物金钱松Pseudolarixamabilis(Nelson)Rehd.干燥根皮或近根树皮。辛,温,有毒。有抗菌消炎、杀虫,抗肿瘤,止痒止血等功效,可治疗疥癣瘙痒、抗生育和抑制肝癌细胞活性等[2~4]。土荆皮的有机酸、乙醇浸膏及苯浸膏,对中国常见的10种致病真菌均有一定的抗菌作用。土荆皮基原植物金钱松为我国特有的单属单种孑遗植物,是植物系统发育重要研究对象,为国家二级保护植物。

木槿皮、川槿皮、紫荆皮、水翁皮与土荆皮名称近似,不易分清。但这些药材来源于不同科属的植物:木槿皮为锦葵科植物木槿HibiscussyriacusL.的干燥茎皮或根皮;川槿皮为木兰科植物南五味子KadsuralongipedunculataFinetetGagnep.的干燥根皮;紫荆皮为大戟科植物余甘子PhyllanthusemblicaL.的干燥树皮;水翁皮为桃金娘科植物水翁Cleistocalyxoperculatus(Roxb.)Merr.etPerry的干燥树皮。此外,豆科植物紫荆CercischinensisBunge的干燥树皮曾为紫荆皮的习用种,也混淆其中。这些药材的化学成分、功能主治、用法用量等均有不同,且土荆皮有毒,不可互相代用。但在临床应用中,常出现混同使用的情况[5~7]。

DNA条形码技术具有鉴定准确且不受被检测对象的形态特征以及发育阶段影响等优点,受到中药鉴定领域的关注。热点条形码序列ITS2序列长度短,多拷贝,扩增简单,测序容易,在中药鉴定方面应用广泛[8~10]。为保证土荆皮等药材的临床用药安全有效,本文使用DNA条形码技术对土荆皮及其易混药材在分子水平进行鉴定研究。

一、材料和方法

1.材料及实验材料

本文37个研究样品来源分别是:2份土荆皮样品来源于山东,均为野生采挖;土荆皮基原植物金钱松新鲜叶片1份;混伪品木槿、紫荆叶片材料各1份,余甘子叶片材料2份(见表1);实验材料由中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员进行鉴定,凭证样本保存于青岛农业大学植物组标本室。土荆皮2条ITS2序列,混伪品木槿皮、川槿皮、紫荆皮、水翁皮共28条ITS2序列,来源于GenBank或由GenBank下载的ITS序列剪切而成(见表2)。

2.pcr扩增、测序及序列

(1)DNA提取制备。

土荆皮近根树皮干燥后,在内部取样约150mg,加约10%PVP-30(聚乙烯吡咯烷酮)粉末后速加液氮研成粉末。再加1mL遇冷的核分离液(10mmol·L-1Tris-HClpH8.0,0.3mol·L-1蔗糖,4‰β-巯基乙醇),放置2min后,4℃下12000g·min-1离心4min,弃上清。用核分离液处理3次后的沉淀加入GP1在65℃水浴过夜。以异丙醇沉淀替代GP2沉淀。其他步骤均按植物基因组DNA提取试剂盒(TiangenBiotechCo.,China)方法进行。新鲜植物叶片在硅胶干燥后,取约10mg样本,加液氮研磨成粉末,再利用试剂盒法提取总DNA。

(2)PCR扩增、测序及数据分析。

引物及反应条件参见文献。采用PCR产物双向测序,用ABI3730XL进行测序。获得的测序峰图利用CodonCodeAligner3.5.7(CodonCodeCo.,USA)校对拼接,去除引物区。ITS序列采用基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去除两端5.8S和28S区段即可获得ITS2间隔区序列。用MEGA5.0计算K2P种间和种内遗传距离,构建NJ系统树。在ITS2在线数据库网站预测ITS2二级结构。

二、结果与分析

1.dna降解严重

从土荆皮药材中提到的基因组DNA电泳后条带均呈弥散状态,且不明亮,说明样品DNA降解严重。虽然有较严重的DNA降解,但并未对PCR扩增产生影响,PCR产物电泳条带明亮,见图1。

2.基因型的遗传关系

土荆皮5个种内样品比对的ITS2序列长度为246bp,GC含量为62.2%~63.0%,具有一个PolyC和一个PolyT结构,共有3个单倍型。其中,KF010589,KF010590和JF7559213条序列为一个单倍型。DQ975356、DQ975355各属于一个单倍型。如图2,DQ975356、DQ975355在169bp处插入碱基C;DQ975356在199bp出现‘T-C’转换。土荆皮种内遗传距离0~0.004,平均值为0.002。从基原植物金钱松叶片获得的ITS2条形码序列的单倍型与从土荆皮药材获得的单倍型一致。

3.木现有序列的分析

34个土荆皮混淆品样本的ITS2序列长度范围为199~230bp,其中序列最长的木槿GQ4