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caspase3在土荆皮酸诱导hela细胞凋亡中的作用

从荆科拉济（pseudolicacidb，pab）提取的二氧化合物可诱导各种肿瘤细胞的细胞死亡。细胞凋亡是凋亡抑制基因和促进基因相互作用的结果。Bcl-2是一种凋亡抑制因子,Caspase3家族则在凋亡通路上产生终末效应事件,使凋亡最终得以完成。这两种基因在PAB诱导宫颈肿瘤凋亡过程中如何变化目前尚无明确结论。本实验试图从细胞凋亡角度探讨PAB对人宫颈癌细胞的作用及对Bcl-2和Caspase3蛋白表达的影响,为PAB用于宫颈癌治疗及探讨其机制提供实验依据。

材料和方法

1.rpmi-1330

土荆皮酸(PAB)购自哈尔滨弘博生物科技有限公司,分子量为432.5,应用时以RPMI-1640培养液稀释;鼠抗人Bcl-2、Caspase3单克隆抗体购自美国SantaCruz公司,Caspase3活性检测试剂盒购自晶美公司(深圳)。

2.细胞培养

按常规贴壁培养宫颈癌HeLa细胞株,取细胞活性大于98%的细胞进行实验。

3.清洗固定固定

将PAB处理后的细胞,制成1×105/ml单细胞悬液,清洗,固定。加入200μ1RNaseA(1g/L),37℃水浴30min,再加PI染色液避光反应30min,上机检测,Multicycle软件分析亚二倍体峰。

4.蛋白凝胶的制备

将PAB处理后的细胞经洗涤、离心后,加入预冷的细胞裂解液0.1ml裂解,离心,取上清测定蛋白含量。分别取各组蛋白依次电泳,转膜,封闭。分别加抗Bcl-2、Caspase3(内参照β-actin抗体)在4℃下孵育,漂洗,再用二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG震荡孵育2h,滴加发光剂,X线片曝光显影,扫描各蛋白条带的含量,重复3次,取均值。

5.casp第三年活性测试

采用ActiveCaspase3ApoptosisKit检测Caspase3活化情况,按试剂盒说明操作。

6.统计方法

采用SPSS11.5统计软件包进行t检验分析。

结果

1.浓度依赖性改变细胞周期分布

FCM显示,不同浓度PAB(2.5,5,10,20μmol/L)作用24h后,呈浓度依赖性改变细胞周期分布,一方面降低G0/G1期的细胞比例,另一方面增高G2/M期细胞的比例,见表1。

2.hela细胞凋亡检测

在DNA图谱G0/G1期前出现一个代表凋亡细胞的亚G1峰。对亚G1峰进行定量分析表明,不同浓度(2.5,5,10,20μmol/L)的PAB作用于HeLa细胞24h后均显示亚G1峰,PAB呈剂量依赖性方式诱导其凋亡,其凋亡率分别为(10.43±1.11)%、(26.90±2.26)%、(45.17±3.14)%、(58.77±3.20)%,对照组无凋亡峰,差异有极显著性(P0.01)。

3.显著性显著性

经不同浓度(2.5,5,10,20μmol/L)PAB处理HeLa细胞24h后,Bcl-2蛋白表达逐渐下降,OD值分别为:12170.55±117.33,10465.11±109.21,8746.60±82.88,6035.69±74.10,4905.20±63.82,差异有显著性(P0.05);Caspase3蛋白表达上调,OD值分别为65.08±7.41,115.56±7.84,140.11±6.66,191.40±5.56,216.88±6.21,差异有极显著性(P0.01)。

4.caspase3的活性

不同浓度(2.5,5,10,20μmol/L)PAB处理HeLa细胞24h后,表达活化Caspase3的细胞百分率分别为(2.85±0.19)%、(11.69±0.28)%、(24.36±0.47)%、(42.77±0.86)%、(63.38±0.70)%,随着PAB浓度的增高,Caspase3活化百分率增高,呈剂量依赖性(P0.01)。

pab诱导caspase3活性的表达

研究报道PAB对多种人类肿瘤有抑制增殖和诱导凋亡作用。本实验结果,PAB处理HeLa细胞后在DNA图谱G0/G1期前出现一个代表细胞凋亡的亚G1峰,呈剂量依赖性诱导细胞发生凋亡,表明PAB对宫颈癌HeLa细胞有凋亡诱导作用。Bcl-2是主要的抗凋亡和促凋亡调节因子,通过调节线粒体功能来调节凋亡,该蛋白分布于线粒体的外膜胞浆表面、内质网和核膜,可稳定线粒体膜并通过蛋白相关转换孔维持膜的通透性。Caspase3为Caspases家族成员