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土荆皮酸对宫颈癌hela细胞端粒酶活性及其细胞周期的影响

土荆皮酸（pseudolicacidb，pab）是从土荆皮中分离得到的新二羟基化合物。根据最近的研究，pab对许多肿瘤细胞有细胞毒性，是一种理想的抗癌天然化合物。端粒酶激活是肿瘤发生过程中关键的一步,端粒酶利用其逆转录酶活性,合成端粒重复序列以维持端粒长度从而使肿瘤细胞获得异常增殖能力。最近的研究发现端粒酶活性在细胞周期的不同阶段有明显的波动,由于宫颈癌的发生与细胞周期调控紊乱有关,因此,针对端粒酶和细胞周期调控异常的研究已成为探讨宫颈癌的发生及治疗的新方向。本研究以HeLa细胞为对象探讨PAB对HeLa细胞端粒酶活性及细胞周期的影响。

1材料和方法

1.1rpmi-1330

土荆皮酸(PAB)购自哈尔滨弘博生物科技有限公司,分子量为432.5,应用时以RPMI-1640培养液稀释;试剂RPMI-1640培养基购自Invitrogen公司,胎牛血清购自Hyclone公司,PI(碘化丙锭)购自Sigma公司,端粒酶PCR-ELISA试剂盒购自美国Roche公司。

1.2细胞培养和复养

人宫颈癌细胞株HeLa细胞购自中科院上海细胞研究所细胞库,HeLa细胞贴壁生长于含10%胎牛血清、青霉素100U/mL和链霉素100mg/mL的RPMI-1640培养液中,置于37℃、5%的CO2饱和湿度培养箱中培养,每两天换1次液。当80%细胞融合时传代培养,取对数生长期细胞用于实验。细胞初始浓度为1×105/ml,设空白对照组、实验组(2.5、5、10、20μmol/L)分别作用HeLa细胞24、48、72和96h。

1.3ssr-pcr检测

操作按照试剂盒说明书进行。收集对照组HeLa细胞及不同浓度PAB处理不同时间后的HeLa细胞裂解,裂解液采用考马斯亮蓝法,以BAS作为标准,用紫外分光光度计进行测定。定量后,按5μg/50μl反应体系进行引物延伸、PCR扩增:94℃预变性3min,94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸90s,共30循环。PCR产物经包被、变性、杂交、酶联抗体、底物反应后,以690nm作为参比波长,测定样品在450nm波长的吸光度(OD)值,差值OD=A450-A690代表细胞端粒酶活性。

1.4乙醇的吹制

收集PAB作用24h的培养细胞PBS洗两遍,取另1支试管,加入5ml70%预冷的乙醇,用吸管吸取细胞悬液迅速吹入固定剂中(乙醇)振荡混匀,4℃冰箱固定18h。将离心固定后的细胞用PBS洗细胞2次,调整细胞浓度为l×106/ml,取1ml离心弃上清,加入1mlPI染液,4℃冰箱避光染色30min后上机检测。

2结果

2.1pab处理对hela细胞端粒酶活性的影响

用不同浓度(2.5～20μmol/L)的PAB处理HeLa不同时间后,分别检测HeLa细胞的端粒酶活性,结果发现,未用PAB处理的HeLa细胞培养24～96h其端粒酶活性无明显变化。在一定浓度范围内(2.5～20μmol/L),相同作用时间(如24h)后,随着PAB浓度增加,其抑制HeLa细胞端粒酶活性的作用亦增强,在各浓度下,随着作用时间的延长,PAB抑制HeLa细胞端粒酶活性的作用亦增强,表明PAB抑制HeLa细胞端粒酶活性的作用具有剂量和时间依赖性。

2.2表2显示了母系比对hela细胞周期分布的影响

经24h培养,随PAB浓度增加,HeLa细胞G2/M期细胞百分比逐渐增加,这表示PAB诱导HeLa细胞G2/M期阻滞。

3pab对hela细胞端粒酶活性的影响

土荆皮酸主要用于真菌感染类的治疗,但其抗肿瘤机制目前并不十分清楚,Tan等发现PAB通过抑制血管过程来抑制肿瘤的形成及发展。GongX等则发现PAB可明显抑制黑色素瘤和HeLa细胞增殖。为深入探讨PAB对宫颈肿瘤细胞的作用,本研究以HeLa细胞为对象进行研究PAB抑制HeLa细胞的端粒酶活性与其细胞周期的关系。本实验发现PAB能显著抑制HeLa细胞端粒酶的活性,在一定浓度范围内,随着PAB作用浓度增加,其抑制HeLa细胞端粒酶活性的作用增强,同样,一定浓度的PAB随着作用时间的延长,其抑制端粒酶活性的作用亦增强,表明PAB对HeLa端粒酶活性的抑制作用呈剂量和时间依赖性,本实验还发现PAB具有阻滞HeLa细胞周期的作用。结果显示,2.5-20μmol/L浓度PAB作用HeLa细胞24小时后,G0/G1及S期细胞比例逐渐减少,G2/M期细胞比例出现不断增加的趋势,呈剂量依赖关系,提示PAB通过阻滞细