SN2565-2010食品中贺氏菌分群检测MPCR-DHPLC法.docxVIP

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T2565—2010

食品中志贺氏菌分群检测MPCR-DHPLC法

GroupingdetectiomofShigellainfood—

MIPCR-DHPLC

2010-05-27发布

2010-12-01实施

国家质量监骨检验检

国家质量监骨检验检疫总局

SN/T2565—2010

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局、山东出入境检验检疫局、西藏出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：郑秋月、曹际娟、雷质文、王秋艳、徐杨、于珂、于灵、王长文、赵昕、徐君怡、

赤列加措。

1

SN/T2565—2010

食品中志贺氏菌分群检测

MPCR…DHPLC法

1范围

本标准规定了食品中志贺氏菌，包括福氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌的

MPCR-DHPLC分群检测方法。

本标准适用于食品中志贺氏菌，包括福氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌的

MPCR-DHPLC快速分群检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T4789.5食品卫生微生物检验志贺氏菌检验

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检验

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

3.1

PCRpolymerasechainreaction

聚合酶链式反应。

3.2

MPCRmultiplexPCR

多重PCR。

3.3

DHPLCdenaturinghighperformanceliquidchromatography

变性高效液相色谱。

3.4

TEAA

三乙基铵乙酸盐。

4生物安全措施

为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按

照GB19489的有关规定执行。

2

SN/T2565-2010

5废弃物处理和防止污染的措施

5.1检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。

5.2检测过程中防止交叉污染的措施按GB/T27403规定执行。

6原理

MPCR,又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。DHPLC分析技术是应用离子对反相液相色谱原理对DNA片段进行分离。离子对采用三乙基胺乙酸盐缓冲溶液(TEAA),核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时TEAA分子中的三个乙基与固定相Cs表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动

相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。

7试剂和材料

除另有规定外，所有试剂纯度应为色谱纯。水为灭菌超纯水，符合GB/T6682中一级水的规格。

所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

7.1TagDNA聚合酶。

7.2dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。

7.310×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。

7.4引物：引物序列见附录A表A.1。

7.5TE溶液。

7.610%SDS。

7.7蛋白酶K(20mg/mL)。

7.8氯化钠溶液(NaCl):5mol/L和0.7mol/L。

7.910%CTAB。

7.10三氯甲烷。

7.11异戊醇。

7.12酚。

7.13异丙醇。

7.1470%乙醇。

7.15DHPLC缓冲液：缓冲溶液A为50ml.TEAA和250μL乙腈混合，加水定容至1000mL;缓冲溶液B为50mLTEAA和250mL乙腈混合，加水定容至1000mL;缓冲溶液D为75%乙腈。

8主要仪器和设备

8.1PCR仪。

8.2DHPLC仪。

8.3高速离