SN 1419-2004疖疮病细菌学诊断操作规程.docxVIP

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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T1419—2004

疖疮病细菌学诊断操作规程

Protocolofbacterialdiagnosisforfurunculosis

2004-06-01发布

2004-12-01实施

中华人民共和国

国家质量监督检验检疫总局

发布

SN/T1419—2004

前言

本标准的附录A和附录B是规范性附录。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检疫局。

本标准主要起草人：薄清如、黄建珍、黄云君、王小玉、冯家望。

本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。

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SN/T1419—2004

疖疮病细菌学诊断操作规程

1范围

本标准规定了疖疮病感染病原-灭鲑气单胞菌的分离鉴定方法。

本标准适用于鲑科鱼疖疮病的检验、疫情监测和流行病学调查。

2仪器、试剂

2.1仪器

显微镜(具油镜、暗视野)、恒温培养箱、接种环、培养皿等。

2.2培养基和试剂

PBG培养基、2%琼脂、蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA培养基)、FA培养基、葡萄糖蛋白胨水、革兰

氏染色液I、Ⅱ、Ⅲ、IV、V-P试剂(培养基和试剂的配制见附录A)。

3分离鉴定步骤

分离鉴定流程见附录B。

4临床诊断

4.1临床分型

急性型病鱼很快死亡，无任何外部症状。亚急性型病情发展较慢，在躯干肌肉上形成典型的疖疮变

化后，陆续死亡。慢性型病鱼长期处于带菌状态，无症状，也不死亡。

4.2临床症状和病理变化

发病鱼表现为离群独游，活动缓慢，体色发黑。在鱼体驱干部，通常在背鳍基部两侧的肌肉组织上出现数个小范围的红肿脓疮向外隆起，柔软浮肿。隆起表面逐渐出血坏死、溃烂而形成溃疡口。溃疡范

围小，不成片。肠道充血发炎，肾脏软化、肿大呈淡红色或暗红色。肝脏退色，脂肪变性。

5采样

健康监测的采样：每个渔场应每六个月检查一次，原则上采集总鱼数的0.2%,最少不应小于150条鱼，从肾、脾、肝等脏器无菌采集样本。如果渔场经实验室检测两年，未发现病原，也尤任何可疑临床症状之后，则认为是无灭鲑气单胞菌的渔场。这样的渔场每年还应检测两次，不过每次采集的样本数可

减少到30条鱼。

临床诊断采样：如果有皮肤病变，则从皮肤病变处取样，同时从肾、脾、肝等脏器中采样。

方法：先用解剖针刺穿头骨，破坏小脑，使鱼失去运动能力。对于皮肤病变部位，用灭菌解剖刀切开疖疮的患部(或溃疡部),无菌采集病变组织。接种TSA培养基，同时作一张涂片用于革兰氏染色，另取少许样品作细菌的运动性检查；对于内脏的采样，则用点燃的酒精棉球擦净、消毒被检鱼体表，在肛门前面0.5cm处用无菌剪刀剪开腹部，然后从此处沿一侧向背部逐步转向头部剪成弧形切口，打开腹腔，无

菌采集脏器。

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6细菌分离

6.1细菌的初分离(两种方法任选一种)

6.1.1PBG培养基接种方法

取肾脏组织(或脾、肝组织)置于无菌研钵中，用无菌杵充分磨碎。取0.5g磨碎的组织放入无菌培养皿中，再倾入45℃~48℃的PBG培养基15mL与之混合均匀，待凝固稍干后加45℃2%琼脂覆盖，琼

脂凝固后把培养基倒置于25℃培养箱内培养72h。

6.1.2TSA培养基培养方法

接种样品于TSA培养基，25℃培养72h。

6.1.3培养结果判定

灭鲑气单胞菌在PBG培养基上形成较小的黄色菌落。在TSA培养基上形成水溶性褐色色素菌落，水溶性褐色色素以菌落为中心，向周围扩展，培养时间越长，颜色越深。如果出现上述两种菌落，则需作下一步试验。每个PBG培养皿上选取三个典型菌落，三个以下时全部接至FA斜面，每个菌落分

别接种一支FA斜面。

6.2FA培养基培养

TSA培养基直接挑取典型菌落，或用接种环刺破表面的琼脂层从PBG培养基取挑典型菌落，接种

到FA斜面；置于25℃培养箱内培养72h,观察有无水溶性褐色色素产生。

7细菌鉴定

7.1细菌染色

取一于净的脱脂载玻片，滴1滴～2滴无菌水，从培养20h～72h、产生水溶性褐色素的FA斜面，用接种环挑取少许菌苔涂片，干燥后火焰上通过三次固定；病变部位组织涂片用同样的方法干燥固定。革兰氏染色液I液染色1min,Ⅱ液染色2min,Ⅲ液脱色至酒精不出现紫色为止，IV液染色1min~2min,用油镜观察染色特性和形态。菌体呈红色表示革兰氏阴性；菌体呈紫色表示革兰氏阳性。灭鲑气单胞菌为革兰氏阴性短杆菌，菌体大小为(0.8μm～1.2μm)X(1.0