SN 1447.1-2004猪传染性胸膜肺炎阻断酶联免疫吸附试验.docxVIP

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T1447.1—2004

猪传染性胸膜肺炎

阻断酶联免疫吸附试验

BlockingELISAforinfectiouspleuropneumoniaofswine

2004-06-01发布

2004-12-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

SN/T1447.1—2004

前言

本标准的附录A为规范性附录。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：周以凤、李树清、胡永强、李健、王巧全。

本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。

SN/T1447.1—20(

猪传染性胸膜肺炎

阻断酶联免疫吸附试验

1范围

本标准规定了阻断酶联免疫吸附试验检测猪传染性胸膜肺炎型特异性抗体的方法。

本标准适用于猪传染性胸膜肺炎的检疫、流行病学调查、诊断和免疫监测。

2材料

2.1试剂

2.1.1磷酸氢二钠(Na?HPO?·12H?O)。

2.1.2磷酸二氢钾(KH?PO?)。

2.1.3氯化钠(NaCl)。

2.1.4柠檬酸(C?H?O?·H?O)。

2.1.5邻苯二胺(OPD)。

2.1.630%过氧化氢(H?O?)。

2.1.7硫酸(H?SO?)。

2.1.8吐温-20(Tween-20)。

2.1.9牛血清白蛋白(BSA)。

2.1.10包被液、稀释液、洗液、酶底物溶液和终止液的配制见附录A。注：所有化学试剂均为分析纯。

2.2仪器设备

2.2.196孔酶标板。

2.2.2多通道、单通道可调移液器及加样头。

2.2.3玻璃试管。

2.2.4试管架。

2.2.5天平(0.0001g)。

2.2.6低速离心机。

2.2.7酸度计。

2.2.8酶标仪。

2.2.9普通冰箱。

2.2.10恒温箱。

2.3标准试剂

2.3.1猪传染性胸膜肺炎标准抗原。

2.3.2猪抗传染性胸膜肺炎标准阳性血清。

2.3.3标准猪阴性血清。

2.3.4兔抗猪传染性胸膜肺炎标准阳性血清。

2.3.5辣根过氧化物酶标记的猪抗兔IgG。3采样

被检动物无菌采血5mL,待血液凝固后，以2000r/min离心10min,分离血清，血清—20℃保存|

2

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4操作方法

4.1包被抗原

将猪传染性胸膜肺炎抗原用包被液稀释成工作浓度，包被酶标板，每孔100μL,加盖后放置4℃冰

箱过夜。

4.2封闭

次日取出酶标板，置37℃恒温箱或室温30min后，弃去包被液，每孔加200μL稀释液，37℃孵育

1h。

4.3洗板

取出酶标板弃去液体后，每孔加洗液300μL,洗板，共三次，每次2min。最后一次倒置拍于、

4.4加样

被检血清用稀释液作1:4稀释，每份血清加2孔，每孔100pL。设立下列对照：猪抗传染性胸膜肺炎标准阳性血清(阳性对照)、标准猪阴性血清(阴性对照)、兔抗猪传染性胸膜肺炎标准阳性血清(兔抗APP对照)、空白对照。阳性、阴性血清对照同被检血清一样，用稀释液作1:4稀释，每个对照加

2孔，每孔100μL。兔抗APP对照和空白对照同样加两孔，每孔加100μL稀释液，37℃作用1h。

4.5加兔抗APP高免血清

用稀释液将兔抗猪传染性胸膜肺炎标准阳性血清稀释成工作浓度，每孔100μL,空白对照每孔加

100μL稀释液，37℃作用30min。

4.6洗板

按4.3操作。

4.7加猪抗兔lgG—辣根过氧化物酶结合物

用稀释液将酶结合物稀释成工作浓度，每孔100μL,37℃作用1h。

4.8洗板

按4.3操作。

4.9加酶底物溶液

每孔加100μL,37℃作用20min。

4.10终止反应

取出反应板，每孔加50μL终止液终止反应。

4.11测吸光值

用酶标仪在490nm波长下，以空白对照为参照，测定其吸光值(OD)。

5数据计算

5.1计算平均吸光值：被检样品和各对照的两孔吸光值之和除以2。

5.2计算相对平均吸光值：被检样品及对照均按式(1)计算相对平均吸光值：

……(1)

式中：

A——相对平均吸光值；

B-—样品(对照)平均吸光值；

C——标准阴性平均吸光值。

6结果判定

6.1对照：阳性对照相对平均吸光值应小于20%,兔抗APP对照相对平均吸光值应大于40%。对照

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成立才能对样品进行判定。

6.2