禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法.docxVIP

1

NY/T680—2003

禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法

1范围

本标准规定了禽白血病病毒(ALV)p27抗原酶联免疫吸附试验方法。

本标准适用于检测鸡蛋蛋清以及鸡胚组织细胞培养物中的ALVp27蛋白抗原。

2p27抗原酶联免疫吸附试验

2.1试验材料

2.1.1试剂

2.1.1.1抗p27蛋白抗体：应用提纯的禽成髓细胞性白血病病毒p27蛋白免疫家兔制备。

2.1.1.2阳性抗原：含鸡白血病/肉瘤病毒群特异性p27蛋白抗原的鸡蛋清。

2.1.1.3阴性抗原：无鸡白血病/肉瘤病毒群特异性p27蛋白抗原的SPF鸡蛋清。

2.1.1.4酶结合物：辣根过氧化物酶标记的抗p27蛋白抗体。

2.1.1.5磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第A.1章。

2.1.1.6包被液：配制见第A.2章。

2.1.1.7洗涤液：配制见第A.3章。

2.1.1.8样品稀释液：配制见第A.4章。

2.1.1.9底物溶液：配制见第A.6章。

2.1.1.10终止液：配制见第A.7章。

2.1.2器材

a)酶联检测仪；

b)聚苯乙烯板；

c)微量加样器，容量50μL～200μL;

d)37℃恒温培养箱。

2.1.3样品

2.1.3.1鸡蛋样品：将待检鸡蛋小的一端朝上放置，打碎蛋壳，用移液器无菌吸取蛋清，密装于灭菌小

瓶内。

2.1.3.2细胞培养物：用移液器无菌吸取细胞培养物，密装于灭菌小瓶内，4℃或-30℃保存或立即送检。试验前将送检样品统一编号，试验时不做稀释。

2.2操作方法

2.2.1用包被液将抗p27蛋白抗体作4000倍稀释，每孔100μL加入96孔聚苯乙烯板中，4℃过夜。

2.2.2取出包被好的聚苯乙烯板，将液体倒弃，每孔加250μL洗涤液漂洗三次，每次2min,甩干。

2.2.3每孔加150μL质量浓度为1%的明胶封闭液，37℃反应60min。

2.2.4重复2.2.2。

2.2.5在A?、A?孔各加100μL标准阴性对照，A?、A?孔各加100μL标准阳性对照。

2.2.6将待检样品加入其他各孔，每个待检样本加两孔，每孔100μL,37℃反应60min。

2.2.7重复2.2.2。

2.2.8每孔加100μL工作浓度的辣根过氧化物酶标记的抗p27蛋白抗体，37℃反应60min。

2

NY/T680—2003

2.2.9重复2.2.2。

2.2.10每孔加100μL新配制的底物溶液，室温，避光反应10min。

2.2.11每孔加100μL终止液。

2.2.12置酶联检测仪于450nm测定各孔吸光度(OD)值。

2.3结果判定

2.3.1阴性对照OD均值等于(A?孔OD值+A?孔OD值)/2;阳性对照OD均值等于(A?孔OD

值+A?孔OD值)/2。

2.3.2阴性对照OD均值小于0.15,阳性对照OD均值减去阴性对照OD均值大于0.3时试验成立，否则重做。

2.3.3S/P等于(样品孔OD均值一阴性对照OD均值)÷(阳性对照OD均值一阴性对照OD均值)。待检样本S/P小于等于0.2判为阴性，表示待检样品中无ALVsp27蛋白抗原。

待检样本S/P大于0.2判为阳性，表示待检样品中有ALVsp27蛋白抗原。

NY/T680—2003

附录A

(规范性附录)

试剂的配制

A.1磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol/LpH7.4)

氯化钠

氯化钾

磷酸二氢钾

十二水磷酸氢二钠

蒸馏水

A.2包被液(0.05mol/LpH9.6)

碳酸钠

碳酸氢钠

蒸馏水

8g

0.2g

0.2g

2.83g

加至1000mL

1.59g

2.93g

加至1000mL

A.3洗涤液

PBS

Tween-20

A.4样品稀释液

含体积分数10%新生牛血清的洗涤液。

A.5磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH5.0)

柠檬酸

十二水磷酸氢二钠

蒸馏水

A.6底物溶液

用二甲基亚砜将3355′-四甲基联苯胺(TMB)

底物溶液。

磷酸盐-柠檬酸缓冲液

1%3355-四甲基联苯胺

30%双