临床免疫学与检验-第六章 沉淀反应.ppt

1.透射免疫比浊法2.散射免疫比浊法3.免疫胶乳比浊法分类免疫浊度测定*第三节凝胶内沉淀试验*可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。原理*原理：抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结合形成沉淀环。环的大小与抗原的浓度成正相关。技术要点：将抗体混入0.9%琼脂糖内（50℃），未凝固前倾注成平板，凝固后打孔（直径3～5mm），孔中加入抗原溶液和不同浓度的标准品，置湿盒内37℃,24～48h观察孔周围是否出现沉淀环。定量试验一、单向扩散试验（平板法）*倾注平板打孔加样放置37℃24～48h观察沉淀环单向扩散试验（平板法）*沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法Mancini曲线：大分子抗原（IgM）时间扩散＞48h，常数K＝C∕d2普通坐标纸曲线Fahey曲线：小分子抗原（IgG,IgA）扩散时间24h常数K＝logC∕d半对数坐标纸曲线C为抗原浓度，d为沉淀环直径单向扩散试验（平板法）*T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线t1为16～24h；t2为24～48h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线Mancini曲线Fahey曲线*影响因素：抗体质量标准曲线，质控血清结果与真实含量不符单克隆抗体；多克隆抗体；可出现假性降低与增高双环现象不同扩散率抗原性相同的两个组分单向扩散试验上排为5个不同浓度的参考品；下排为患者血清，下排右2为异常病理血清单向扩散试验（平板法）*原理：将抗原抗体分别加在琼脂糖不同的对应孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径为3mm，孔间距在3～5mm之间，在相对的孔中加入抗原或抗体，放置湿盒37℃18～24h后，观察孔周围是否出现沉淀环。鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一二、双向扩散试验（平板法）*应用1.抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计2.抗原或抗体相对分子量的估计双向扩散试验（平板法）*应用3.抗原性质的分析双向扩散试验（平板法）*应用4.抗体效价的滴定5.抗原或抗体纯度的鉴定双向扩散试验（平板法）*第四节免疫电泳技术*优点：1.加快反应的速度。2.提高了灵敏度。3.增加了分辨率。电泳分析＋沉淀反应抗原抗体反应的高度特异性电泳技术的高分辨率、快速、微量免疫电泳技术*原理：双向扩散+电泳比双向扩散试验灵敏度提高8～16倍技术要点：制备1.2%巴比妥琼脂凝胶板，在其上成对打孔，孔径3mm，孔距6mm，于阴极侧孔内加待测血清，阳性侧孔加抗血清，电泳条件3～4mA/cm，30min～1h。一、对流免疫电泳*通电－蛋白质抗原常带较强的负电荷，在电场中向正极移动抗体球蛋白带负电荷较少，籍电渗作用向负极泳动＋对流免疫电泳*结果分析：无沉淀线出现则表明无相应的抗原。沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度＞抗原，反之，则是抗体浓度＜抗原浓度。对流免疫电泳*电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。原理单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术二、火箭免疫电泳*1.2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适量抗血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品，样品孔放负极侧，6h后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。技术要点火箭免疫电泳*********************

第六章沉淀反应*第六章沉淀反应第一节沉淀反应的特点第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验二、免疫浊度测定*第三节凝胶内沉淀试验一、单向扩散试验二、双向扩散试验第四节免疫电泳技术一、对流免疫电泳二、火箭免疫电泳三、免疫电泳四、免疫固定电泳思考题