Nrf缺陷损害小鼠食管黏膜的屏障功能专家讲座.pptx

Nrf2缺点损害小鼠食管黏膜屏障功效冬威敏建Nrf缺陷损害小鼠食管黏膜的屏障功能专家讲座第1页

内容验证Nrf2参加食管黏膜屏障功效，在抵抗胃食管反流病中发挥保护作用目标人食管样品获取、小鼠手术模型建立；测定跨膜电阻；食管黏膜超微结构改变镜检；食管黏膜ATP含量测定；基因芯片、免疫组化、Western杂交和染色质免疫共沉淀评价基因表示试验设计Nrf2缺点经过破坏依赖能量紧密连接而损害食管屏障功效结论Nrf缺陷损害小鼠食管黏膜的屏障功能专家讲座第2页

食管黏膜屏障功效黏膜屏障系统由3部分组成：上皮前屏障——包含表面黏液层（作用低到能够忽略），不移动水层和上皮细胞分泌碳酸氢根离子；上皮屏障——包含多层磷状上皮细胞膜、细胞间连接复合物（紧密蛋白、糖蛋白机制和缓冲剂）、细胞内缓冲剂、和膜离子转运蛋白；上皮后屏障——包含血液流动和酸碱平衡Nrf缺陷损害小鼠食管黏膜的屏障功能专家讲座第3页

细胞质1（Nfe2L2，红细胞衍生核因子2样蛋白2）属于转录因子CNC家族，含有亮氨酸拉链结构（bZip结构），调整解毒和抗氧化应激相关酶表示，是一个主要细胞防御路径Nrf2蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1，一个与胞浆肌动蛋白结合含624个氨基酸多肽，是细胞氧化应激反应中主要调控因子细胞核内主要转录因子，可调整细胞内各种蛋白表示、细胞分化和凋亡，一样含有bZip结构。大Maf蛋白能够直接活化对应基因，小Maf蛋白必须与其它含有转录活性bZip蛋白结合，形成异源二聚体促进基因转录，或本身形成同源二聚体抑制基因转录Keap1蛋白小Maf蛋白正常生理条件氧化应激或外源物质刺激细胞核ARENrf2信号通路在小鼠食管黏膜发育成熟阶段被激活。在这个阶段，角质化复层磷状上皮连续变厚，最终形成成人食管黏膜。因为角质化层是主要抵抗物理应激和化学损伤保护层，末端分化角质化细胞表示能够经过淬灭活性氧来提供保护作用蛋白，故推测Nrf2可能参加食管黏膜屏障功效，可能在胃食管反流病中发挥保护作用。

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试验设计人类食管活检样品采样人排除条件；10副正常人和非糜烂性胃食管反流病患者活检组织样品；在胃镜检验期间从（食管）5cm近端到胃食管连接处取得。动物手术模型建立8周龄野生型和Nrf2缺点型C57BL/6J小鼠，每组5只。麻醉之后经过上中线切口进行吻合手术。食管胃吻合手术目标是消除括约肌功效，允许自由胃液反流，建立胃反流模型；食管胃十二指肠吻合术加胃切除术是为了取得十二指肠反流模型；食管胃十二指肠吻合术是为了取得混合反流模型。吻合手术之后，清洗腹腔，用6-0丝线缝合腹腔。Nrf缺陷损害小鼠食管黏膜的屏障功能专家讲座第5页

十二指肠食管胃吻合术：在食管远端和前胃处作3个越5mm切口，然后准确地黏膜对黏膜纵向缝合。食管胃十二指肠吻合术：在食管和十二指肠上作2个5mm切口，然后准确黏膜对黏膜缝合。食管胃十二指肠吻合术加胃切除术：除了食管胃十二指肠吻合术，在胃食管连接处和幽门处结扎后切除胃部。Nrf缺陷损害小鼠食管黏膜的屏障功能专家讲座第6页

试验设计测跨膜电阻：食管黏膜组织浸入冰凉富氧林格氏溶液，马上在迷你尤斯灌流室将黏膜一侧朝上固定住。平衡30min后，在2h内每15min，获取一次PD（电势差）、Isc(短路电流)和RT（总电阻）基础电子读数。食管黏膜超微结构改变镜检：每组处死上3只鼠，切开食管黏膜组织，用二甲胂酸缓冲液固定，之后用醋酸铀酰染色，以聚/床812树脂包裹，超薄切片机切厚薄两种切片，厚切片用甲苯胺蓝硼砂染色后，光镜下为薄切片寻找适合镜检区域，薄切片固定在铜栅格上，用醋酸铀酰和雷诺柠檬酸铅进行双染，透射电子显微镜镜检。用显微生物学组件分析镜检照片上最少30个细胞细胞间隙和电子致密物质密度。细胞间隙是测定两个相邻细胞细胞膜之间区域。细胞间隙中电子致密物质密度用除以细胞间隙得到平均灰度值计算。用方差分析比较各组之间差异。Nrf缺陷损害小鼠食管黏膜的屏障功能专家讲座第7页

试验设计RNA分离：每组处死3只鼠，切开食管黏膜，用RNA组织提取试剂盒提取总RNA，凝胶电泳测质量，分光光度计测浓度，生物分析仪测RNA完整性（RIN）。（RIN是RNA降解程度指标，RNARIN必须在7以上才适合做芯片分析）基因表示谱分析：文中芯片分析就是基因表示谱分析，目标是分析对照组和模型组食管黏膜组织中各种差异表示基因和基因簇及其丰度。（基因表示谱是经过构建处于某一特定状态下细胞或组织非偏性cDNA文库，大规模cDNA测