生化实验报告(数据处理).doc

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习

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告

班级：生物技术08

指导教师：敖新宇、贾璐

学号：

姓名：

日期：2009-12-19

生物化学综合实验

摘要：本次实验包括苯丙氨酸解氨酶的纯化及其活性测定和大玉米粉中营养成分的测定两个实验。

关键词：苯丙氨酸解氨酶、SephadexG—25层析、DEAE纤维素层析、活力、比活力、大玉米粉、凯式定氮法、索式提取法、3，5—二硝基水杨酸比色法。

实验一苯丙氨酸解氨酶的纯化及其活性测定

一实验目的

1.学习掌握分离纯化生物大分子的方法；

2.学习掌握酶活性的测定方法；

3.了解在分离纯化过程中酶活性的变化；

4.了解高速冷冻离心机的操作步骤

二实验原理

苯丙氨酸解氨酶（L—phenylalanine:ammonialyase,简称PAL；EC4.3.1.5）是

植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切相关，在植物生长发育和抵制病菌侵害过程中起重要作用。PAL催化L—苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。规定1h内增加0.01为PAL的一个活力单位。酶的比活力是指样品中每毫克蛋白质所含的酶活力单位数。在实验中将会看到随着PAL的逐步被纯化，其比活力也在逐步增加。

在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠等）使蛋白质沉淀析出称为盐析。溶液的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱和溶液称100%饱和度。沉淀一种酶所需的具体浓度需要经实验确定。

Sephadex(交联葡萄糖凝胶)是有细菌葡聚糖长连，用交联剂1—氯2—，3—环氯丙烷交联而成。凝胶商品名后面的G值表示每克干胶吸水量（毫升数）的10倍。交联度大，网孔小；交联度小，网孔大。交联度的大小还与凝胶颗粒的机械强度有关，交联度大，机械强度也大（硬胶），在柱层析中流速快。

根据需要，选用一定型号的的凝胶柱做柱层析介质（蛋白脱盐一般用G—25或G—50，G—100~G—200分离不同分子质量的蛋白组分）。由于被分离物质的分子大小和形状不同，分子质量大的进入凝胶网孔中被阻滞，从而后流出层析住，达到分离的目的。

DEAE纤维素是以天然纤维素为母体联结了二乙基氨基制备而成的。DEAE纤维素柱层析属于阴离子交换层析的一种，DEAE纤维素经过处理上柱后，由于静电吸力等可吸引在固定相和流动相中的一些阴离子（如ＯＨˉ、Clˉ等）。

蛋白质粉在水溶液中可以作为两性解离，控制溶液PH，可使蛋白质分子或成为阴离子，或成为阳离子。对于DEAE纤维素而言，应使酶溶液PH大于酶蛋白分子的PH，使其成为阴离子。

在实验中还要测定蛋白质的含量，用考马斯亮蓝法。考马斯亮蓝法是染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者的最大光吸收在456nm。在一定的蛋白质浓度范围内（0—100微克/毫升），蛋白质-色素结合物在波长595nm处的光吸收与蛋白质的含量成正比，故可以用蛋白质的定量测定。而且该反应非常灵敏，可用于测微克级蛋白含量。

三、实验器材

1.材料：土豆

2.仪器：

高速冷冻离心机、研钵、恒温水浴锅、电子天平、试管、烧杯、剪刀、量杯、层析柱、移液枪、胶头滴管、蛋白质核酸自动分析仪、紫外分光光度仪、可见分光光度仪。

3.试剂：0.1mol/L硼酸—硼砂缓冲液（PH8.7）、酶提取液：硼酸—硼砂缓冲液（含0.1mol/LEDTA、20mol/Lβ-巯基乙醇）、0.6mol/LL-苯丙氨酸溶液、6mol/LHCL、固体硫酸铵、0.02mol/L磷酸盐缓冲液、sephadexG-25、DEAE纤维素52、标准蛋白质溶液（100μg/mlmL）、考马斯亮蓝G-250蛋白质染色液。

四、实验步骤

1.酶液体取

（1）用电子天平称去土豆5g，剪成小段，加入体积酶提取液，于冰浴上同时加半勺左右的石英砂，用研钵研成浆。

（2）用胶头滴管将已经匀浆的酶液转入离心管，再用少量的提取液冲洗研钵及研棒，将冲洗液转移到同一个离心管中，在1000转离心10分钟。

（3）取离心后的上清液（即粗酶提取液），倒入量筒量出其体积（14.0ml），放置冰箱中备用。

（4）从酶粗体取液中吸出1m