多聚酶链式反应扩增学案.pptx

第2课时

多聚酶链式反应扩增DNA片段;知识点;1.PCR扩增的方向:通常将DNA的羟基(—OH)末端称为④,而磷酸基团末端称为⑤。DNA的合成方向总是从子链的⑥

延伸。?

2.PCR原理(即利用DNA复制原理):双链DNA⑨

。

;3.PCR反应的条件:PCR反应需要在⑩中才能进行,需提供:DNA模板,,四种脱氧核苷酸,

,同时要控制温度。?

4.PCR扩增的过程:反应的每一轮循环都包括、和延伸三步。?

(1)变性:温度以上,双链DNA在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA。?

(2)复性:温度下降到50℃左右,两种引物通过与两条单链DNA结合。?

(3)延伸:温度上升到左右,在聚合酶的作用下,以四种脱氧核苷酸为原料,根据碱基互补配对原则,从引物的5→3端延伸合成与模板互补的DNA新链。;1.准??。

2.移液:用按照配方在微量离心管中依次加入各组分。?

3.混合:盖严离心管的盖子,用手指轻轻弹击壁管。

4.离心:将微量离心管放在离心机上,离心约10s,目的是

。?

5.反应:将离心管放入PCR仪中,设置程序进行反应。;1.DNA复制为什么需要引物?如何理解DNA复制的方向?DNA热变性原理是什么?;项目;例1(1)PCR利用了DNA的原理,在的高温下,作为模板的解聚为,这个过程称为

。?

(2)PCR反应需要的条件:、、

、、。?

(3)在PCR反应中与解旋酶作用相同的操作是

。;技巧归纳

PCR扩增的原理

1.当温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚为单链,称为变性。

2.当温度下降到50℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合,称为复性。

3.当温度上升到72℃左右时,溶液中的四种脱氧核苷酸(A,T,C,G)在DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链,称为延伸。

4.72℃左右时,TaqDNA聚合酶有最大活性,可使DNA新链由5端向3端延伸。DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列,使该段固定长度的序列呈指数扩增。;知识点二:PCR的反应过程及实验设计;(3)PCR循环第三步延伸模板是什么?需要什么酶?遵循什么原则?;3.如何测定DNA的含量?;知识总结

1.PCR反应的实验操作:①按配方将所需试剂摆放在实验桌上(准备);②用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分(移液);③盖严离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管壁(混合);④将微量离心管放在离心机上(离心);⑤将离心管放入PCR仪上,设置好PCR仪的循环程序(反应)。

2.每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。

3.从第二轮循环开始,上一次循环的产物也可以作为模板参与反应,并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合,进行DNA的延伸,这样,DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列,使这段固定长度的序列呈指数扩增。

4.PCR操作时要注意做到:①隔离操作区,所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等必须进行高压灭菌;②分装试剂,简化操作程序,使用一次性枪头。;例2下列关于PCR实验操作过程的叙述错误的是()。

A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌

B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存

C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化

D.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换

;技巧归纳

PCR技术特点:

1.PCR不需要解旋酶,而生物体内DNA复制时需要解旋酶。

2.PCR需要耐热的DNA聚合酶,而生物体内DNA聚合酶在高温时会变性。

3.PCR一般需经三十多次循环,而生物体内DNA复制需要生物体自身的控制。

4.为避免外源DNA等因素的污染,实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌;所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存。

5.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头