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HPLC-UV测定加替沙星的血药浓度

背景

1.高效液相色谱：

高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

高效液相色谱仪结构：①高压输液泵：驱动流动相和样品通过色谱分离柱和检测系统；

②色谱柱：分离样品中的各个物质；

③进样器：将待分析样品引入色谱系统；

④检测器：将被分析组在柱流出液中浓度的变化转化为光学或电学信号；

⑤馏分收集器：为做其它波谱鉴定或获取少量试验样品的小型制备，进行馏分收集；

⑥数据获取与处理系统：把检测器检测到的信号显示出来。

2.加替沙星是又一新型氟哇诺酮的C位用3一甲基呱嗓基取代的衍生物。具有抗菌谱广,抗菌活性强的特点。加替沙星对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、厌氧菌、需氧菌及非典型致病原均有较强的活性，同时又具有口服吸收好,体内分布广,光毒性小等特点。

二、目的

掌握如何利用高效液相的方法测定家兔血清中加替沙星血浆药物浓度。

研究注射液加替沙星在家兔体内的药代动力学特征。

三、材料

仪器：高效液相色谱仪、离心机、涡旋振荡仪；

试剂：乌拉坦、加替沙星注射液、空白血浆、标准液、10%高氯酸溶液，所用溶液均为分析纯。

四、方法

动物实验：

取健康家兔，称重，耳缘静脉注射乌拉坦（5ml/kg）麻醉，固定。耳缘静脉注射加替沙星注射液（30ml/kg），给药停止后分别于2,5,10,15,30,45,60,90,120min时进行血液样本采集，每次取血0.5ml，所用方法为股动脉取血，所取血液样本装入无菌微量离心管。

色谱条件：

色谱柱：ZORBAXExtend-C184.6×150mm；

流动相：甲醇：0.05mol/L柠檬酸=25:75（pH=3）；

流速：1mL/min；

检测波长：293nm；

柱温：40℃；

进样量：20μL。

绘制标准曲线：

无菌微量离心管中加入空白血浆90μL、标准液10μL、10%高氯酸溶液100μL，涡旋振荡3min，然后12000rpm离心10min，取上清液120μL。取20μL上清液进样，进行HPLC分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线。

样品测定：

取100μL样品，加入100μL高氯酸溶液，剩余步骤同标准曲线，以取血时间为横坐标，峰面积为纵坐标作样本学药浓度曲线。

五、实验结果

标准曲线

血药浓度曲线

时间（min）

2

5

10

15

30

45

60

90

120

面积

515464

385129

268089

200687

129184

105598

82258

62914

46352

浓度（μg/ml)

38.48

28.66

19.847

14.769

9.383

7.606

4.909

4.3909

3.143

浓度对数

1.585235063

1.457276186

110.972341716

0.881156321

0.690993032

0.642553546

0.497344381

药动学参数计算：

由浓度时间曲线推断为房二室模型

由浓度对数时间曲线得：

分布速率常数α=0.0818lgA=1.6481药物的分布半衰期t1/2α=7.81min

消除速率常数β=0.0074lgB=0.9008药物的消除半衰期t1/2β=86.35min=1.43h

初始血药浓度C0=38.48(μg/mＬ)

血药浓度－时间曲线下总面积AUC=41格*20μg/mＬ·min=13.67(μg/mＬ·h)

Vd=(30mg/kg)*(2kg)/38.48(μg/mＬ)=1.559L

CL=0.692(Ｌ/h)

MRT=1/0.0074=135.13min

六、讨论

.采血：每只兔耳耳缘静脉有两条，采血前均应备齐，以免采血时不慎将血管破坏后不能及时采血；采集血样时应从耳尖向耳根方向依次取血，如任意采血，后几个点因血管被破坏无法采到；每次采血时应先使其剧烈运动，加速血液循环，便于采血；采血还应注意取血手法，应用中指垫住耳背，食指与无名指确定采血曲间，快而稳的进针，抽血时要慢，因耳缘静脉血管较细，如抽血过快血管易抽瘪，无法采血。

样品处理：