酶免疫技术（免疫学检验技术课件）.pptx

酶免疫技术;免疫标记技术;;酶免疫技术

就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体抗原反应的特异性，也不影响酶活性，即在相应而合适的作用底物参与下，表现为呈色反应。呈色反应显示了酶的存在，从而证明发生了相应的抗体抗原反应。

这是一种特异而敏感的技术，可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。;分为两类

1）酶免疫组织化学技术（EIHCT）

可定性、定位

2）酶免疫测定法（EIA）

可定性、定量

－－非均相免疫酶测定法：①固相酶免疫测定：酶联免疫吸附试验（ELISA）应用最广泛；②液相酶免疫测定

－－均相免疫酶测定法

;;一、常用的酶及底物;辣根过氧化物酶（HRP）;HRP的???物;HRP的常见底物;

碱性磷酸酶（AP）

;OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。;AP的

底物;制备方法要求;酶免疫技术的核心组成部分;抗原要求纯度高，抗原性完整;制备方法;标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度;标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度;酶标记物的鉴定主要有：

1、酶活性和抗体（抗原）免疫活性的鉴定

2、酶标记率的测定;（一）要求;（二）固相载体的种类;

第二节酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbantassay,ELISA）

;酶联免疫吸附试验

(enzymelinkedimmunosorbantassay,ELISA)

是一种固相免疫测定技术。先将抗体（抗原）包被到固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检抗原（抗体）和酶标抗体（抗原）按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体（抗原）发生反应，形成免疫复合物，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。

;;预期结果;1、双抗体夹心法

方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色

应用：用于检测大分子抗原：乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等;;;2、双位点一步法：;方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。

应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）;;;;2、双抗原夹心法

原理：类似双抗体夹心法

操作步骤：类似

应用：乙型肝炎表面抗体;;3、竞争法

原理：类似检测抗原的竞争法

应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测;4、捕获法

应用：

病原体急性感染诊断中的IgM型抗体

甲型肝炎HAV-IgM抗体

乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体;;;在应用此法时需注意RF(IgM类)及其他非特异IgM的干扰。RF(IgM类)既能与固相载体上的IgM第二抗体结合，又能与随后加入的酶标抗体（IgG）结合，从而导致假阳性结果。

此外，非特异性IgM在第一步时可与特异性IgM竞争结合固相抗体，从而影响检测的灵敏度;三、ELISA的关键技术;

3．酶标结合物的制备

（二）最适工作浓度的选择;（三）测定方法的标准化;四、评价与应用;应用;固相的抗原或抗体;用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定;最具代表性的两种技术;均相酶免疫测定：

1.EMIT(酶扩大免疫测定技术):

2.克隆酶供体免疫测定：

;EMIT示意图;CEDIA示意图;均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。;第三节膜载体的酶免