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柞蚕TNFAIP8基因的鉴定及生物信息学分析

摘要：柞蚕是鳞翅目大蚕蛾科的一种大型昆虫，也是一类重要的经济绢丝昆虫。进行柞蚕TNFIP8基因序列的克隆，使用传统Trizol法提取柞蚕组织总RNA，经PCR特异性扩增肿瘤坏死因子α诱导蛋白８（Tumornecrosis

factoralpha-inducedprotein8，TNFAIP8）基因并将目的片段连接至T-载体，测序获得TNFIP8基因的序列。同时对从柞蚕中获得TNFIP8基因并进行其生物信息学分析，为下一步研究该蛋白生物学功能提供参考。

关键词：柞蚕；TNFAIP8；克隆；生物信息学分析

1.前言

1.1TNFAIP8基因的简介

TNFAIP8家族主要由TNFAIP8（TIPE）、TNFAIP8L1（TIPE1）、TNFAIP8L2（TIPE2）、TNFAIP8L3（TIPE3）四种具有高度序列同源性的基因组成。2002年，科学家首次发现了TIPE2基因，它位于人类的第一号染色体上，小鼠的第三号染色体上，两者相似度高达百分之九十四，氨基酸序列上具有一个184个氨基酸组成的性阅读框架。

TNFAIP8家族的序列具有高度同源性，氨基末端都含有调节细胞凋亡的死亡效应结构域，羧基末端却缺了一个半胱氨基酸。TIPE2结构具有特性，中心存在一个巨大的疏水腔[1]。

1.2TNFAIP8基因的功能

1.2.1维持结肠稳态作用

TIPE在炎症问题上具有重要作用，可以做到保障结肠稳态和降低结肠炎的患病风险，肠道炎症类疾病是重要的健康问题。

TNFAIP8是细菌感染和肿瘤癌症的重要影响因素，会在多种肿瘤癌症中高度表达，并且TIPE可以潜在调控结肠上皮细胞的增殖与死亡，但研究结果尚不明确。

在骨髓嵌合实验中，在非造血干细胞中的TIPE缺陷可加重TIPE缺陷小数结肠炎，发生死亡率升高、体重大幅度下降、机体出现炎症反应、发生细菌感染、患结肠炎症甚至是严重的腹泻和肠道出血等问题。

在哺乳动物中，TIPE家族具有高度保守的氨基酸序列，由TIPE、TIPE1、TIPE2、和TIPE3四种组成，可以做到对先天免疫系统的调控、对蛋白激酶AKT激活的促进，使得多种蛋白质磷酸化，从而调控上皮细胞的凋亡，即TIPE可能通过靶向AKT调控上皮细胞死亡,还可能导致细胞的转移问题，总而言之，TIPE不仅可以调控细胞的凋亡与增殖，还会参与细胞的迁移与转移。

而黏膜系统的完整性对维持稳态至关重要，上皮细胞的凋亡破坏了上皮系统的完整性，完整性又与细菌侵染以及各类炎症反应的发生有很大的相关性，然而炎症与癌症的发生又密切相关，这就表示可能导致各种疾病甚至肿瘤癌症的出现[2]。

1.2.2维持免疫系统稳态作用

TNFAIP8蛋白含有一个死亡效应域，从而阻断caspase3介导的细胞凋亡。TNFAIP8的下调能做到对胸腺细胞的有效保护，不受糖皮质激素的诱导从而导致胸腺细胞发生凋亡。TNFAIP8可能可以作为细胞死亡与稳态的分子水平上的联系。

TIPE2作为TNFAIP8家族中的一员，也具有6个保守的α螺旋，与TNFAIP8具有很高的序列同源性，可以优先在髓细胞中表达，也可以在其他细胞中诱导表达出现，是维持稳态的必要成分，可以有效避免小鼠的脾肿大、多种炎症问题以及死亡时间过早。TIPE2可以对免疫细胞功能进行负调控，所以TIPE2在体内的选择性表达可以做到防止高反应性的发生以及免疫系统的稳态维持[3][4][5]。

1.2.3抗细菌感染作用

TIPE2蛋白优先在造血细胞中表达，可以在吞噬以及氧化爆发两个先天性免疫效应臂中发挥负调控作用。TIPE2能够将TLRs和Rac连接形成先天性免疫的负调控因子，从而阻断RacGTPases有效控制吞噬与氧化爆发的强弱，进而控制细菌感染。

吞噬作用与氧化破裂相互协同抵抗细菌感染，二者缺一不可，否则就会引起免疫缺陷问题和严重的感染问题，与此类疾病的发生呈负相关。二者的作用机理：吞噬作用可以吞噬传染性的微生物，氧化爆发向吞噬体中注入液泡活性氧，协同作用杀死传染性微生物[6]。

1.2.4促进炎症作用

TNF促进炎症的作用的关键在于TNF能影响多种靶细胞从而促进炎症反应，其中很重要的一种就是内皮细胞，但它并不是被动影响，而是主动参与。在日本脑炎病毒诱导的神经炎症已经被研究证实的作用机理中，TNFAIP3会作为miR-29b的标靶调控小胶质细胞的激活，从而作为负调控因子在这一神经炎症的形成中发挥作用。内皮细胞被激活后产生的单核细胞趋化素可能使得TNF拥有间接的血管生成活性。并且TNF还能做到影响大量的基因的表达，产生多效性作用。TNFAIP3作为一类抑制抗炎蛋白，能使得NF-jB被持续激活，产生促炎细胞因子[7