食品微生物鉴定技术和方法.ppt

第二章食品微生物鉴定技术和方法1.DNA同源性和DNA中（G+C）摩尔分数（G+C)%=（G+C)/(A+T+C+G)%Tm法（热变温度法）测定菌株间相差2.5～4.0％；种间相差5～10％以上；属间相差10％以上第二节食品微生物学的现代鉴定方法每个生物种都有特定的GC%范围，因此可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为25--75%，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。logo但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系。G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性，从分子水平上判断物种的亲缘关系。同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在4～5%以下；同属不同种的差别应低于10～15%；G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要意义。01若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差别大于5%，则肯定不是同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。02第二章食品微生物鉴定技术和方法第二节食品微生物学的现代鉴定方法1.DNA同源性Southernblotting（DNA-DNA)Northernblotting(DNA-RNA)Westernblotting(Pro-Anti)Easternblotting第二章食品微生物鉴定技术和方法第二节食品微生物学的现代鉴定方法2.23S、16S、5SrRNA序列相似性核糖体70S

30S50S

16S213423S+5S蛋白质第二章食品微生物鉴定技术和方法第二节食品微生物学的现代鉴定方法16S亚基保守性高，是细菌进化的计时器普遍存在细胞RNA含量较高rRNA稳定16sRNA序列保守16sRNA分子量适中16SrRNA基因约含有1540个核苷酸，分可变区和保守区，不同微生物可变区核苷酸序列不同，从而可以利用这些特异性序列进行微生物的鉴定；DomainbacteriaDomainarchaeaDomaineukaryota紫色细菌线粒体甲烷球菌属甲烷杆菌属真菌植物叶绿体革兰氏阳性细菌甲烷八叠球菌属极端嗜盐菌动物蓝细菌无硫绿细菌热球菌属伪变形虫纤毛虫黄杆菌栖热胞菌属热网菌属热变形细菌粘菌鞭毛虫产液菌属微孢子毛滴虫双滴虫（假滴虫属）--------------生物总系统发育树（根据16SrRNA序列比较绘制，引自《布氏微生物学》2000）第二章食品微生物鉴定技术和方法第二节食品微生物学的现代鉴定方法具体测定方法：采用RNaseT1酶可以将16SrRNA酶解在G位点上切割，得到6～20个碱基大小的序列对这些6～20碱基片段进行分离、测序比较不同微生物之间SAB（Dice型相关系数）的相似性。第二章食品微生物鉴定技术和方法第二节食品微生物学的现代鉴定方法SAB=2×NAB/（NA+NB）NAB代表两菌所含相同寡核苷酸的碱基总数，NA和NB分别代表两菌寡核苷酸所含碱基总数SAB等于1，说明所比较的两菌株rRNA序列相同，是同一进化时间的微生物，若SAB值小于0.1，两菌亲缘关系很远第二章食品微生物鉴定技术和方法01第二节食品微生物学的现代鉴定方法02分子生物学技术在细菌鉴定中的应用核酸探针技术核酸扩增技术（PCR技术）基因芯片技术03这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链叫DNA分子核酸探针或基因探针。核酸探针技术原理：两条不同来源的核酸链如果具有互补的碱基序列，就能够特异性的结合而成为分子杂交链。据此，将己知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入己变性的被检DNA样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的。制备核酸探针要注意两个关键性的问题：要选择特异性强而又无交叉反应的核酸(DNA或RNA)片段，可通过核酸重组和克隆以及人工合成、PCR扩增等技术获得