Geobacillus thermodenitrificans来源L-阿拉伯糖异构酶催化多功能性研究.pdf

摘要

酶促反应被认为是具有高效性，高选择性且环境友好型的一种反应。天然酶的功能

通常朝着生物体在自然界生存所需的方向进化，因此研究酶催化多功能性机制，并建立

起有效的酶催化多功能性进化策略是如今酶工程最主要的研究方向之一。本研究前期利

用Geobacillusthermodenitrificans来源、EscherichiacoliMG1655来源和Bacillussubtilis

168来源L-阿拉伯糖异构酶（L-arabinoseisomerase，L-AI）对尿苷进行催化，发现该酶

既能催化L-阿拉伯糖为L-核酮糖的异构化反应，也可以催化尿苷发生磷酸化反应生成

D-核糖-1-磷酸和尿嘧啶。在此基础上，本文以G.thermodenitrificans来源L-AI为研究

对象，对其进行了基因克隆与异源表达、酶的分离纯化、酶学性质、结构模拟、半理性

设计拓展底物谱等方面的研究，主要从以下四个方面进行展开：

1）通过分子克隆技术构建G.thermodenitrificans来源、E.coliMG1655来源和B.

subtilis168来源L-AI的重组质粒（以下简称GtAI、EcAI和BsAI）。以E.coliBL21(DE3)

为宿主菌对三种来源L-AI进行异源表达，利用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化目的蛋白，

并对重组蛋白活性进行初步验证。

2）利用HPLC/MS鉴定L-AI在PB缓冲液中催化尿苷的产物，测定并分析三种来

源L-AI催化磷酸化反应时的酶学性质和动力学常数。

3）利用SWISS-MODEL进行同源建模得到GtAI的单体结构模型，以尿苷分子为

配体进行分子对接，并对配体尿苷5Å范围内氨基酸进行丙氨酸扫描。

4）测定野生型GtAI的底物谱。根据对接结果对GtAI进行基于拓宽底物谱的半理

性设计。

酶催化反应具有专一性，这使得酶促合成方法经常受到酶催化剂种类少、反应类型

有限、底物谱窄、成本高等限制。本研究前期发现L-阿拉伯糖异构酶具有催化多功能性，

为嘌呤与嘧啶核苷间的转化提供了新思路，因此研究L-阿拉伯糖异构酶催化多功能性具

有重要意义。

关键词：L-阿拉伯糖异构酶，核苷，催化多功能性，结构预测，定点突变

Abstract

Enzymaticreactionisconsideredtobeefficient,selectiveandenvironment-friendly.However,natural

enzymesarelimitedandusuallyevolvedinthewaywhichtheyneedtosurvive.Therefore,asoneofthemost

importantresearchdirectionsofenzymeengineering,themechanismofenzymepromiscuityneedestablish

effectiveevolutionarystrategies.Themultifunctionalcatalyticperformanceofenzymesisofgreatscientific

andbiotechnologicalinterest.L-arabinoseisomerase(L-AI)catalyzestheisomerizationofL-arabinosetoL-

ribuloseandwidelyappliedinthebioproductionofkindofsurges.Inthisstudy,theperformanceofL-AI

thatcatalyzesthephosphorylationofuridinetoD-ribose-1-phosphateanduracilwascharacterized.The

molecularmechanismofphosphorylationwasexplored.AndsubstratespectrumofL-AIfrom