咪唑类物质KK-42对日本沼虾表皮C型凝集素基因表达的影响.pdf

摘要

日本沼虾（Macrobrachiumnipponense）是我国重要的淡水经济养殖虾类，由于外界

环境、养殖密度等因素，日本沼虾易感染病原体导致死亡率增加。实验室前期研究显示，

咪唑类物质KK-42可以提高日本沼虾对嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）的清除

率和生存率，其机理可能与通过诱导日本沼虾血细胞和肝胰腺等免疫因子表达有关。C

型凝集素（C-typelectins，CTLs）作为重要模式识别受体，可以激活细胞和体液免疫反

应，发挥重要免疫作用。研究表明，甲壳动物的表皮不仅起到物理屏障的作用，而且还

发现一些免疫因子，而表皮CTLs的研究相对缺乏。为了探究KK-42对表皮CTLs基因

表达的影响，基于前期转录组数据，本研究利用RT-PCR和RACE技术首次从日本沼虾

表皮发现了3条CTLs基因，命名为MnCTL1、MnCTL2和MnCTL3，利用生物信息学、

RT-qPCR和RNAi等方法，研究了基因序列特征、时空表达模式、以及嗜水气单胞菌攻

毒、KK-42处理后MnCTL1转录水平以及日本沼虾死亡率的变化，初步探究了表皮

MnCTL1在日本沼虾免疫系统的作用以及KK-42对MnCTL1的调节。研究结果不仅为阐

明表皮在甲壳动物免疫系统中的作用积累了资料，而且为探究KK-42提高日本沼虾存活

率的机制提供了理论依据。具体结果如下：

（1）从日本沼虾表皮克隆和鉴定了3条新的CTLs基因的cDNA序列全长，分别

命名为MnCTL1、MnCTL2、MnCTL3。MnCTL1的cDNA序列全长分别为1141bp，编

码211个氨基酸，含有一个信号肽和C型凝集素结构域（C-typelectin-likedomain，

CTLD），预测蛋白分子量和等电点分别为22.7kDa和6.33，含有4个O-连接的糖基化

98203

位点和16个磷酸化位点。其CTLD具有4个保守半胱氨酸残基（Cys-Cys、

176195167166165

Cys-Cys）、结合半乳糖的保守基序QPD（Gln-Pro-Asp）、WHD

1901911922+166167191192

（Trp-His-Asp）和Ca结合位点（P，D，H和D），符合“短型”CTLD

的结构特征。经多序列比对和进化树分析显示，MnCTL1与中国明对虾（Fenneropenaeus

chinensis，XP_042892943.1）和斑节对虾（Penaeusmonodon，XP_037801890.1）具有最

高的同源性，都为71.92%；与其他甲壳动物CTLs聚为一支。

MnCTL2和MnCTL3的cDNA序列全长分别为1306bp、993bp，分别编码187、177

I

个氨基酸，都分别具有一个信号肽和CTLD，其中MnCTL3还具有结合甘露糖的特征性

基序EPN；MnCTL2和MnCTL3分别与日本囊对虾（Marsupenaeusjaponicus，

XP_042866054.1）和（M.japonicus，XP_042880252.1）同源性最高，分别为38.13%和

93.01%；分别与不同甲壳动物CTLs聚为一支。

（2）RT-PCR结果显示，MnCTL1在多种组织表达，不仅在腹部表皮呈现较高水平

的表达，还包括鳃、胃、肌肉、心脏、肝胰腺、血细胞等组织。

（3）RT-qPCR结果显示，表皮MnCTL1转录水平的变化与蜕皮周期有关。以蜕皮

间期（C期）为对照，MnCTL1在蜕皮前期和蜕皮后期的相对表达量极显著增加，其中

在蜕皮后晚期最高，增加了12.48倍（P0.01），提示：表皮MnCTL1表达的变化可能

与蜕皮周期过程中表皮上皮细胞活性的变化有关。

（4）嗜水气单胞菌攻毒结果显示：在C期虾的腹部第二节注射2μL嗜水气单胞菌