细胞培养中的研究方法.ppt

1低电压电泳，利于DNA分离32尽量用去尖头的枪头吸取DNA液，防止人为剪切提DNA时细胞数勿太多，否则酶解不全，DNA液粘稠注意：200bp400bp600bp800bp3.原位切口末端标记法（原位细胞凋亡检测，TUNEL）原理：细胞凋亡时，内源性核酸内切酶使核小体内DNA断裂出现缺口，产生一系列3‘-OH末端。生物素（biotin）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下与3‘-OH末端连接，并与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，加入DAB显色底物可在原位出现棕沉淀，镜下即可观察和计数着色细胞；正常或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。组织样本和细胞样本（细胞涂片）均可检测。优点：对完整凋亡细胞进行原位染色，能准确反应凋亡细胞典型的生化和形态特征，极少量的凋亡细胞也可被检测出来，灵敏度高于染色法和DNALadder，应用广。注意：设好阳性及阴性对照，控制好药物处理时间TDT酶与生物素-dUTP混合液现用现配DAB显色时间勿过长细胞爬片操作要轻柔(详见下节)流式细胞术测定法20世纪70年代出现。特点：在单细胞水平上对大量细胞作准确快速分析和分选。应用：1.判断细胞体积、DNA含量、蛋白含量、酶活性、细胞膜受体、表面抗原等。2.无菌状态下，对活细胞分类收集，纯度达99%。四、流式细胞术01流动室、液流系统02激光光源光学系统03光电管、检测系统04计算机、分析系统经荧光染色的单细胞悬液在气体压力下进入流动室，在鞘液约束下细胞排成单列从喷嘴喷出，形成细胞流。其与激光束垂直相交，细胞被激发出荧光，经光学系统收集后，传给计算机系统储存、分析并显示。01用不同单克隆抗体或荧光染料，可对一个细胞同时进行多个参数检测。011.检测单细胞不同指标工作原理：当细胞液滴逐个通过激光束时，干涉检测器被激活，而带荧光标记的细胞同时也使荧光检测器激活，液滴充电信号使液滴带上负电荷，从而向正极移动，进入荧光标记细胞收集器，纯度达99%以上。无菌状态下进行时，得到细胞仍可继续体外培养，进行后续研究。2.细胞分选调试和校准：激光强度、液流速度、光路等、由专业技术人员进行。仪器操作：①打开细胞仪②打开联机电脑③在气压阀减压状态下确认鞘液桶充满并保证管路通畅④气压阀加压排出管路气泡⑤样品管加去离子水冲洗喷嘴系统⑥预热5-10min开始试验完毕后去离子水冲洗⑦分析结果流式细胞仪使用直接用荧光素（FITC、PE等）标记的抗体处理细胞，进行检测（可同时加入几种不同荧光标记的抗体）。此法操作简单，结果准确，易于分析。1.直接荧光标记法：细胞先与一抗结合，再加荧光标记的二抗检测。此法费用低，但特异性差（二抗多为多克隆抗体），应设好阴阳对照。不适合细胞数少的标本测定。2.间接荧光标记法：常规样品制备方法原理：细胞表面保留有完整的抗原，用荧光标记的特异性抗体与细胞表面抗原结合，依荧光强度或阳性百分率可知相应抗原密度。步骤：①对数期细胞单细胞悬液，PBS洗涤，调浓度为1×107个/ml；②取100ul，加血清封闭；③加抗原避光孵育20min，PBS洗涤2次；④弃上清，用固定液固定细胞；⑤检测1.检测细胞膜受体应用实例检测结果上机前细胞浓度1×106个/ml，过高或低均影响结果设立对照抗体孵育后充分洗涤，轻柔混匀，低速离心，以减少重叠细胞和细胞碎片孵育时避光注意事项细胞培养中的研究方法侯桂琴郑州大学药学院细胞生长状况观察细胞活力测定细胞凋亡检测流式细胞术常用单细胞分离技术内容提要常规观察细胞计数细胞生长曲线细胞分裂指数细胞贴壁率细胞周期一、细胞生长状况观察倒置显微镜下观察，生长状态好的细胞透明度大，细胞内颗粒少，没有空泡。包膜清晰。培养液清澈透明，无悬浮细胞和碎片。01从培养基颜色判断：正常桃红色，当变浅变黄，需换液或传代。02培养液浑浊，液体内漂浮菌丝或细菌，表示微生物污染。03细胞生长变慢，支原体污染。041.常规观察血球计数板计数法电子计数仪计数法2.细胞计数细胞数/ml＝（4大格细胞总数/4）×104×稀释倍数血球计数板计数法电子计数仪计数法原理：台盼蓝排斥法。再结合CCD成像，快速准确完成细胞计数和存活率计数。电子计数仪计数结果注意事项：01细胞分散度较好，成单细胞悬液。02取样计数前混匀细胞03计数时，2个以上细胞组成的细胞团按单个细胞计算，细胞团占10%以上，说明消化不充分；细胞数少于2个/mm3或多于50