蛋白质的共价结构.ppt

丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光吸收，检测灵敏度可以达到1?10-9mol,比DNFB法灵敏100倍。异硫氰酸苯酯(PITC)法:N末端氨基酸生成相应的PTH（苯乙内酰硫脲）–AA，并脱离肽链，可连续测定N末端氨基酸，广泛应用于肽链的的氨基酸序列测定。氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个水解肽链，释放氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，可以确定蛋白质的N-末端残基。2.C-末端的测定还原法。C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的α氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。单击此处添加小标题1单击此处添加小标题肼解法。多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离，C末端氨基酸可用纸层析鉴定。但精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。2羧肽酶法。将蛋白质在pH8.0,30℃与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸的排列顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。通常将二者混合使用。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，因而，除用来测定C末端氨基酸外，还可以用来测定氨基酸的排列顺序。二硫桥的断裂过甲酸氧化法巯基化合物还原法氨基酸组成的分析一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。目前用氨基酸自动分析仪，2－4小时即可完成。蛋白质的氨基酸组成，一般用每分子蛋白质中所含的氨基酸分子数表示。不同种类的蛋白质，其氨基酸组成相差很大。多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化肽段的分离纯化可用层析法或电泳法可以用酶水解法或化学水解法将蛋白质水解成肽段溴化氰断裂法羟胺断裂法：断裂Asn-Gly之间的肽键，但专一性不强，也可以断裂Asn-Leu和Asn-Ala之间的键.Edman化学降解法:用此原理已制成蛋白质序列分析仪。若每次循环的准确度为99%，经60次循环，准确度为：0.9960=0.54肽段氨基酸序列的测定降解法：可用氨肽酶和羧肽酶，只能测出末端的几个氨基酸。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，有可能以此为基础开发出新的氨基酸的顺序测定仪。根据核苷酸序列推定法：分离mRNA，经反转录测定cDNA的核苷酸序列,再用遗传密码推定氨基酸序列。质谱法：可分析微量的肽链，短肽在第一台质谱仪中经电喷射电离，按荷质比分离，依次在经碰撞池被裂解成离子碎片，在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线，推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白质组学中应用广泛，但不能区分亮氨酸和异亮氨酸。肽段在多肽链中次序的决定肽段二硫桥位置的确定用对角线电泳法?蛋白质测序举例（胰岛素的序列测定）蛋白质序列数据库欧洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研究所共同管理的SWISS-PROT有10多万条肽链的信息；美国国家生物医学基金会主持的PIR有近30万条肽链的信息，但多数由核酸信息翻译而来，有些未经严格检验。美国政府支持的GenBank和欧洲的EMBL有大量的基因序列信息，从其阅读框可以得到蛋白质序列的不少信息。细胞色素C的物种差异同源蛋白质的物种差异与生物进化蛋白质的氨基酸序列与生物功能第4章蛋白质的共价结构—、蛋白质通论(一)蛋白质的化学组成和分类蛋白质的元素组成：C、H、O、N、S,其中含N平均为16%，这一数据可用于蛋白质的含量测定。1.简单蛋白完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分。根据溶解性的不同，可将简单蛋白分为7类：清蛋白（溶于水）、球蛋白（溶于稀盐溶液）、谷蛋白（溶于稀酸或稀碱）、醇溶蛋白（溶于70%-80%的乙醇）、组蛋白（溶于水或稀酸，可用稀氨水沉淀）、精蛋白（溶于水或稀酸，不溶于氨水）和硬蛋白（只能溶于强酸）。2.结合蛋白由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。根据辅基的不同，可将结合蛋白分为以下7类：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和金属蛋白。3.按蛋白质的生物学功能分类（1）催化功能生物体内的酶都是由蛋白质构成的，没有酶，生物体内的各种化学反应就无法正常进行。（2）结构功