酶联免疫方法的原理及详细操作步骤.pptVIP

1.4免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate）；固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）；酶反应的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。2ELISA的类型此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。双抗体夹心法测抗原用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。2.2.2双抗原夹心法测抗体2.2.3间接法测抗体传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。竞争法测抗体2.2.5竞争法测抗原小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。IgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期诊断。捕获包被法测抗体2.2.7ABS-ELISA法：固相支持物；1：样品；2：特异性IgG；3：生物素化抗小鼠IgG（Biotin）；4：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）；5：DAB显色液；6：显色；73.ELISA的试剂(A、B、C三部分)ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；酶标记的抗原或抗体（结合物）；酶的底物；阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；结合物及标本的稀释液；洗涤液；酶反应终止液ELISA的试剂准备A固相载体聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。包被的方式01将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。02不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。01亲和素生物素即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。02脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。03优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。04天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。01合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。02包被用抗原：包被用抗体01IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。023.1.5包被的条件pH9.6碳酸盐缓冲液pH7.2的磷酸盐缓冲液pH7-8的Tris-HCL缓冲液。加入