酶学与酶工程第五章酶分子修饰学生.pptVIP

使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。非共价修饰0102用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍共价修饰0102修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。(均相反应,无毒害)修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。大分子修饰(共价)的过程聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。酶半衰期相对稳定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240聚乙二醇-SOD35h350a、胃蛋白酶原的激活利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。五、肽链有限水解修饰有限水解意味着水解酶量和时间相对少同时由于水解部位氨基酸”埋”在蛋白位置差异,氨基酸周围肽段引起的氨基酸pK值和电性变化,使同样氨基酸部位水解程度也可能不同酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。氨基酸置换修饰将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修饰。修饰方法：化学修饰法、定点突变技术通过各种物理方法使酶分子的空间结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法称为酶分子的物理修饰。通过酶分子的物理修饰，可以了解在不同物理条件下特别是在高温、高压、高盐、低温、真空、失重、极端pH、有毒等极端环境下，由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。第三节酶分子的物理修饰酶分子物理修饰的特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变。只是在物理因素的作用下，次级键发生某些变化和重排，使酶分子的空间构象发生某些改变。酶分子空间构象的改变还可以在某些变性剂的作用下，首先使酶分子原有的空间构象破坏，然后在不同的物理条件下，使酶分子重新构建空间构象。1例如：2首先用盐酸胍使胰蛋白酶的原有空间构象被破坏，通过透析除去变性剂后，在不同的温度条件下，使酶重新构建新的空间构象。3结果表明：在20℃的条件下重新构建的胰蛋白酶与天然酶的稳定性基本相同，而在50℃的条件下重新构建的酶的稳定性比天然酶提高5倍。工具酶限制性内切酶II型酶的识别序列通常为4-6bP，具有回文结构，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5’或3’末端突出的粘性末端(stickyend)。GAATTCDNA连接酶DNA聚合酶末端脱氧核苷酰转移酶载体1外源DNA本身没有自主复制能力，导入宿主细胞后不能随宿主细胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段扩增的目的。如果要将外源DNA导人宿主细胞进行扩增成表达，就需要外源DNA与某种能在宿主细胞中进行自主复制和表达的DNA重组，并由其携带进入宿主细胞。这种可以用来插人外源DNA片段构建