DB37T 1826-2011 猪圆环病毒2型环介导等温扩增技术.docxVIP

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DB37

山东省地方标准DB37/T1826—2011

猪圆环病毒2型环介导等温扩增技术

Loop-mediatedisothermalamplificationforporcinecircovirustype2

2011-04-08发布2011-06-01实施

山东省质量技术监督局发布

I

DB37/TXXXX—XXXX

前言

本标准的编制依据GB/T1.1-2009的规定。

本标准由山东省农业科学院提出。

本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。

本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所；青岛农业大学。

本标准主要起草人：王金宝、李俊、吴家强、韩偲、时建立、周顺、丛晓燕、徐绍建、孙文博、杜以军。

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猪圆环病毒2型环介导等温扩增技术

1范围

本标准规定了猪圆环病毒2型（PCV2）的环介导等温扩增（LAMP）检测技术的要求。本标准适用于猪血清和组织中猪圆环病毒2型的检测。

2材料

2.1器材

2.1.1微量移液器（最大量程为10μL、20μL、100μL、1000μL）

2.1.220000g低温离心机

2.1.3电热恒温水槽

2.1.4稳流稳压电泳仪

2.1.5水平电泳槽

2.1.6凝胶成像系统

2.2紫外透射反射分析仪试剂

2.2.1蛋白酶K溶液（20mg/mL）：配制见附录A.1章

2.2.210%十二烷基硫酸钠（SDS溶液，pH7.2）：配制见附录A.2章

2.2.3Tris平衡酚

2.2.4三氯甲烷

2.2.5无水乙醇

2.2.670%乙醇：配制见附录A.3章。

2.2.75mol/LBetaine溶液：配制见附录A.4章2.2.8100mmol/LMgSO4溶液：配制见附录A.5章2.2.9BstDNAPolymerase（8U/μL）

2.2.10SYBRGreenⅠ核酸染料

2.2.110.5×TBE缓冲液：配制见附录A.6章。

2.2.12电泳级1%琼脂糖：配制见附录A.7章。

2.2.1310mg/mL的溴化乙锭（EB）水溶液。

2.2.14DNAMarker20002.3引物

F3：5’-CTCCAGTGCTGTTATTCTAGATGA-3’B3：5’-TTTCCAGCAGTTTGTAGTCTCA-3’

FIP：5’-GAAGGGCTGGGTTATGGTATGGC-TTTT-ACAGCCCTCACCTATGACC-3’

BIP：5’-CCGCTACTTTACCCCCAAACCT-TTTT-GCCACAGCTGATTTCTTTTGTTG-3’

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3方法

3.1病料处理

将病料剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐水1∶5倍稀释，取悬液反复冻融3次，5000g离心15min，取上清液-20℃保存备用。

3.2病毒DNA的提取

3.2.1取上清液（或血清）500μL加入10%SDS溶液50μL、20mg/mL蛋白酶K溶液10μL，于55℃水浴

2-3h。

3.2.2加入200μLTris饱和酚，充分混匀，10000g离心15min

3.2.3取上清液，加入200μLTris饱和酚和200μL三氯甲烷，10000g离心15min。3.2.4取上清液，加入200μL三氯甲烷，10000g离心15min。

3.2.5取上清液，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20min，10000g离心15min。

3.2.6弃上清液，加入70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。

3.2.7加入20μL灭菌超纯水溶解沉淀，-20℃保存备用。

3.3环介导等温扩增（LAMP）详见表1。

表1环介导等温扩增反应体系

步骤1

10×ThermoPol

2.5μL

步骤2

dNTP混合液(10mmol/L)

1.5μL

步骤3

B3/F3(5μmol/L)

2.0μL×2

步骤4

BIP/FIP(50μmol/L)

1.0μL×2

步骤5

MgSO4(100mmol/L)

1.0μL

步骤6

Betaine(5mol/L)

2.5μL

步骤7

DNA

1.0μL

步骤8

BstDNAP