基因工程和核酸杂交.pptVIP

**2、溶液的離子強度溶液中離子與DNA分子中磷酸基團形成離子鍵，需要較高溫度才能使DNA變性。離子強度較低時，Tm值較低，而且解鏈的溫度範圍也較寬。*3、pH值pH值影響氫鍵的形成。pH值在5-9範圍內，Tm值變化不明顯。pH值小於4或大於11時，均不利於氫鍵的形成，DNA容易變性。*4、變性劑干擾堿基堆積力和氫鍵的形成，因此可以降低Tm值。常用的變性劑有甲醯胺、尿素、甲醛等。*8.1.2核酸複性複性（renaturation）：指變性DNA在適當條件下，二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現象，它是變性的一種逆轉過程。退火（annealing）：熱變性DNA一般經緩慢冷卻後即可複性，此過程稱之為“退火”。雙鏈DNA、RNA雙鏈區、DNA:RNA雜交雙鏈以及其他異源雙鏈核酸分子都具有此性質。*核酸複性的影響因素溫度和時間DNA濃度DNA分子大小和複雜度離子強度*1、溫度和時間一般認為比Tm低25℃左右的溫度是複性的最佳條件，越遠離此溫度，複性速度就越慢。複性時溫度下降必須是一緩慢過程，若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫（如4℃以下），複性幾乎是不可能的。*2、DNA濃度DNA複性的第一步是兩個單鏈分子間的相互作用“成核”。“成核”速度與DNA濃度的平方成正比。溶液中DNA分子越多，相互碰撞結合“成核”的機會越大。*3、DNA分子大小和複雜度用非重複堿基對（bp）數表示核酸分子的複雜性。簡單順序的DNA分子，如多聚（A）和多聚（T）這二種單鏈序列複性時，互補堿基的配對較易實現。順序複雜的DNA，如小牛DNA的非重複部分（一般以單拷貝存在於基因組中），這種複雜的特定序列要實現互補，顯然要比上述簡單序列困難得多。*1)粘性末端連接3、目的基因和載體的連接本法適用於在質粒和目的基因上有相同單或雙酶切位點。*粘性末端DNA重組體的構建3?HO-G━━━━━CTTAA-p5?5?p-AATTC━━━━━G-OH3?3?HO-G━━━━━CTTAA-p5?5?p-AATTC━━━━━G-OH3?質粒目的基因━━━━━━━━━━━━━━━━目的基因和載體連接EcoRⅠEcoRⅠ鹼性磷酸酶3?HO-G━━━━━CTTAA-OH5?5?HO-AATTC━━━━━G-OH3?退火DNA連接酶3?HO-G━━━━━CTTAAG━━━━━CTTAA-p5?5?p–AATTC━━━━━GAATTC━━━━━G-OH3?*2)平末端連接質粒和目的基因上沒有相同的酶切位點質粒產生平末端的內切酶DNA連接酶目的基因產生粘性末端的內切酶產生粘性末端的內切酶核酸酶S1核酸酶S1*人工接頭本法適用於在質粒和目的基因上沒有相同的酶切位點。*本法適用於在質粒和目的基因上沒有相同的酶切位點。通過同聚尾連接*質粒目的基因━━━━━━━━━━━━━━━━3?3?3?ACGTC━━━━━G5?5?G━━━━━CTGCA3?3?GnGGGACGTC━━━━━G5?5?G━━━━━CTGCAGGGGn3?3?CnCCC━━━━━5?5?━━━━━CCCCn3?末端轉移酶dGTP末端轉移酶dCTP混合，退火1）轉化細菌2）體內修復同聚尾連接法構建DNA重組體GCCCC━━━━━GGGGACGTCCTGCAGGGG━━━━━CCCCGPstⅠ?核酸外切酶目的基因和載體連接GACGTCCTGCAGGACGTCCTGCAGCCC━━━━━━━GGGGGG━━━━━━━CCCPstⅠPstⅠ*4、重組DNA導入受體細胞常用的受體細胞是大腸桿菌。轉化（transformation）：是指以質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。感受態細胞(competentcell)：細胞膜結構改變、通透性增加並具有攝取外源DNA能力的細胞。*製備感受態細胞的基本方法CaCl2處理，增加大腸桿菌細胞膜通透性。電擊法，高壓脈衝使細胞膜形成暫時性微孔。*1）重組體的篩選根據載體的抗藥性標誌篩選大多數質粒載體帶有抗生素抗性基因（如Ampr、Tetr等），當帶有完整