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（三）腺相關病毒載體單鏈線狀DNA缺陷型病毒，4.7kb；可以整合至宿主細胞基因組，穩定表達；安全，無致病性，B19定位整合至19q13；容量小，可引起免疫反應，感染效率較RV低（四）單純性皰疹病毒載體對神經系統的嗜向性，在神經元中可長期潛伏性感染；不需要宿主細胞分裂；不整合，安全；改造後喪失神經毒性，可容納較大外源片段，較易製備；可對感染的正常細胞產生毒性。二）基因轉移的非生物學方法㈠脂質體㈡直接注射㈢受體介導基因轉移技術㈣其他方法㈠脂質體(liposome)脂質體是由脂類形成的一種可以高效包裝DNA的人造單層膜，是一種脂質雙層包圍水溶液的脂質微球。其結構和性質與細胞膜極為相似，二者易於融合，DNA由於細胞的內吞作用進入細胞。人工脂質體膜具有如下特點：與體細胞相容，無毒性和免疫原性可生物降解，不會在體內堆積可製成球狀(0.03~50?m)，包容大小不同的生物活性分子可帶有不同的電荷具有不同的膜脂流動性、穩定性、及溫度敏感性，能適應不同的生理要求㈡直接注射方法：注射，包埋溶液類型對基因表達有影響 重組DNA可貯存於5%~30%的蔗糖溶液中，也可用生理鹽水或PBS。㈢受體介導基因轉移技術受體介導的細胞內吞作用特點具有細胞、組織或器官專一性，配體只能被一些特異的細胞吞噬；配體進入細胞的轉移效率很高。核酸運載工具配體+多聚賴氨酸（PL）配體—PL—核酸脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）配體肝細胞脫唾液酸糖蛋白受體㈣其他方法磷酸鈣共沉澱法電穿孔法顯微注射法DEAE-葡聚糖法類型方法主要優點主要缺點反轉錄病毒穩定整合，易操作僅轉染分裂細胞，有插入突變風險腺病毒-$安全性高，易製備短暫表達，可誘導免疫反應病毒介導腺相關病毒定點整合，無致病性難製備，容量較小單純性皰疹病毒有神經組織特異性難制備，有細胞毒性脂質體介導易制備，操作簡便轉導效率低，短暫表達受體介導特異組織靶向性易降解，表達水平較低非病毒介導直接注射安全性高，操作簡便轉移效率低磷酸鈣共沉澱易制備轉移效率低細胞顯微注射特異細胞靶向性操作複雜，表達效率差異大基因槍無病毒序列瞬間表達，表達效率差異大表13-1各種基因轉移方法特點比較第三節基因干預的基本技術原理與方法一、反義RNA反義RNA（anti-senseRNA，asRNA）是一種含有與被調控基因所產生的mRNA互補的堿基序列的小分子RNA。它能通過堿基配對與對應的mRNA結合，形成雙鏈複合物，影響mRNA的正常修飾、翻譯等過程，從而封閉或抑制基因的正常表達，起到調控作用。㈠反義RNA在基因治療中的意義及 需解決的問題利用反義RNA對體外培養的細胞進行基因干預體外合成反義RNA，直接作用於培養細胞，細胞吸收RNA後，發揮作用；構建轉錄反義RNA的重組質粒，導入細胞，轉錄出反義RNA而發揮作用。關鍵問題特異性轉移問題反義RNA的降解問題ASGP—PL—反義RNA 利用ASGP受體介導系統，在細胞水準(HepG2細胞系)可以特異性抑制乙肝病毒基因的表達。硫代磷酸核苷酸 硫代修飾的反義寡核苷酸穩定性大大增強,但硫代寡核苷酸毒性較大也使其應用受到限制。㈡受體介導反義RNA轉移技術㈢應用前景安全性高反義RNA設計和製備方便具有劑量調節效應能直接作用於一些RNA病毒與核酶技術聯合應用RNA干擾(RNAinterfererice，RNAi)是一種由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的mRNA被降解，導致蛋白無法合成，出現“基因沉默”，而這一過程便被稱為RNAi。二、RNA干擾（二）RNAi的作用機制 在哺乳動物中RNAi的作用機制與植物及果蠅等低等生物基本相似,RNAi是一個依賴ATP的過程,siRNA通過堿基互補配對識別具有同源序列的mRNA,並介導其降解。 RNAi的作用過程分3個步驟:(1)較長的dsRNA被一種稱為Dicer的核酸酶識別切割成21～23nt的siRNA。小干涉RNA（smallinterferingRNA,siRNA）的特點長約21～23bp，具5′單磷酸和3′羥基末端,互補雙鏈的3′端均有一個2～3nt(nucleotide)的單鏈突出。最有效的siRNA是3′突出2個尿嘧啶的21nt的dsRNA。Dicer是RNAi所必需的酶,屬於RNaseIII家族,是ATP依賴性核酸內切酶，具有高度的保守性。Dicer