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正文

果胶酶的固定化及其活力测定

一、目的：

果胶酶（EC.3.2.1.15）广泛存在于植物界，参与果实的成熟及其它代谢过程。在果品加工业中，

果胶酶主要用于果汁的澄清和提高榨汁率。果胶酶的固定化将有助于提高酶的利用率，同时还可减

少外源物质对果制品的污染。果胶酶需求量大，且多为一次性使用，既造成了很大的浪费，又大大

提高了产品生产成本。固定化果胶酶可以重复多次使用，能够减少果胶酶的使用量，节约生产成本。

通过本实验，了解载体的制备方法，掌握酶的固定化原理及方法。

二、原理：

本实验固定化方法为共价结合法。以壳聚糖为载体，通过戊二醛共价交联固定化果胶酶。壳聚

糖是从蟹、虾外壳中提取的一种氨基多糖（α-氨基-1.4-β-葡萄糖多聚物），对人和动物无毒副作用，

是一种具有网状结构，机械性能好，化学性质稳定，耐热性好的酶固定化载体材料，特别是壳聚糖

分子中含有游离的氨基，通过化学交联剂（如戊二醛）很容易与酶发生间接共价结合，使酶牢固地

固定在壳聚糖分子上。果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸,可用DNS法定量：3,5-二硝基水杨酸与醛糖

共热能产生棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和含有呈色氨基化合物的反应液颜色深

浅成正比，在540nm下测其吸光度，从而可计算出果胶酶活力。

三、试剂及仪器

仪器：冷冻离心机分光光光度计比色皿（8只）摇床水浴箱混合振荡器

天平瓷盘药匙剪刀(1把)记号笔（1支）通风橱吸水纸

具塞刻度试管（4支）三角瓶（2支）烧杯（100ml×3个）试管架（1个）

试管（6支）量筒（100ml×1个）滴管（16个）离心管(5ml×2个,50ml×1个)

移液管架(1个)移液管(2ml×3个,5ml×1个)注射器（1支）滴管(1个)

吸耳球（1个）洗瓶（1个）玻棒（1个）烧杯(300ml×5个)

试剂：乙酸－乙酸钠缓冲液（0.2mol/L,pH5.0）

磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.0)3,5－二硝基水杨酸

氢氧化钠冰醋酸丙三醇戊二醛无水乙醇浓盐酸

果胶酶果胶半乳糖醛酸壳聚糖蒸馏水若干桶

四、方法步骤

1载体的制备

1.1取壳聚糖4g加入180ml的3%的乙酸中，加20ml甘油搅拌溶解，制得壳聚糖溶液。

1.2每组配制60ml10%的NaOH溶液,均分到三个小烧杯中。用注射器吸取约3ml壳聚糖的溶液滴入

10%的NaOH溶液中，即得到壳聚糖的微珠。每组共做三份相同量的微珠，静置10min，蒸馏水浸洗

至中性，最后三份微珠各用20mlpH7.0的磷酸缓冲液浸洗一次（3min）。

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1.3倾去磷酸缓冲液，进行下面步骤。

2载体的活化

三份载体中各加入4%的戊二醛溶液约20ml，过夜或者室温活化5h，中间摇动。

3偶联

3.1取果胶酶0.1g，加入18ml水、2ml乙酸－乙酸钠缓冲液，摇床上振荡提取5h，8000rpm离心10min，

上清液即初始酶液，留2ml酶液置于一支干净的5ml离心管中4℃备用，其余18ml酶液进行下面实

验。

3.2水洗除去游离戊二醛（5min×5次）。

3.3将活化的三份载体合并，用所剩酶液覆盖载体，4℃过夜，中间摇动几次。

4活性的检测

4.1水洗除去游离酶（2min×4次），回收在小三角瓶中的滤液即残余酶液置于4℃备用。收集小球，

滤纸吸干，称重。另取两份各20粒微珠，各自称重，4℃保存备用。

4.2取两支试管编号按下表所述步骤加样，进行固定化酶的酶活测定(20粒固定化酶颗粒称重)：

操作步骤对照管反应管

0.4％果胶4ml0.4％果胶4ml

1

50℃水浴中预热5min50℃水浴中预热5min

23mlpH5.0乙酸－乙酸钠缓冲液3mlpH5.0乙酸－乙酸钠缓冲液