体外哺乳细胞染色体畸变试验.docx

中华人民共和国国家标准

GB15193．23—2014

食品安全国家标准

体外哺乳类细胞染色体畸变试验

(报批稿)

2014-12-01发布

2015-05-01实施

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会

发布

1

GB15193．23—2014

食品安全国家标准

体外哺乳类细胞染色体畸变试验

1范围

本标准规定了体外哺乳类细胞染色体畸变试验的基本试验方法和技术要求。

本标准适用于评价受试物的体外哺乳类细胞染色体畸变。

2术语和定义

2．1染色体结构畸变

通过显微镜可以直接观察到的发生在细胞有丝分裂中期的染色体结构变化。如染色体中间缺失和断片、染色体互换等。染色体结构畸变可分为染色体型畸变(chromosome-typeaberration)和染色单体型畸变(chromatid-typeaberration)。

2．1．1染色体型畸变

染色体结构损伤，表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组等改变。2．1．2染色单体型畸变

染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组等改变。

2．2有丝分裂指数

中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是反映细胞增殖程度的指标。

2．3核内复制

在DNA复制的S期之后，细胞核未进行有丝分裂就开始了另一个S期的过程。其结果是染色体有4、8、16…倍的染色单体。

2．4裂隙

染色体或染色单体损伤的长度小于一个染色单体的宽度，为染色单体的最小错误排列。3试验目的和原理

通过检测受试物是否诱发体外培养的哺乳类细胞染色体畸变，评价受试物致突变的可能性。在加入或不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳类细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂(如秋水仙素或秋水仙胺)处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞、制片、染色、分析染色体畸变。

4仪器和试剂

4．1仪器

细胞培养箱，倒置显微镜，超净台，离心机。

2

GB15193．23—2014

4．2培养液

常用Eagle’sMEM培养液(minimumessentialmedium，MEM)，也可选用其他合适培养液。加入抗菌素(青霉素按100IU／mL、链霉素100μg／mL)，将灭活的胎牛血清或小牛血清按10％的比例加入培养液。

4．3代谢活化系统

4．3．1s9辅助因子的配制

4．3．1．1镁钾溶液

氯化镁1．9g和氯化钾6．15g加蒸馏水溶解至100mL。

4．3．1．20．2mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．4)

磷酸氢二钠(Na2HPO4，28．4g／L)440mL，磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O，27．6g／L)60mL，调pH至7．4，0．103MPa20min灭菌或滤菌。

4．3．1．3辅酶-I(氧化型)溶液

无菌条件下称取辅酶-Ⅱ，用无菌蒸馏水溶解配制成0．025mol／L溶液，现用现配。4．3．1．4葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液

称取葡萄糖-6-磷酸钠盐，用蒸馏水溶解配制成0．05mol／L，过滤灭菌。现用现配。4．3．2大鼠肝s9组分的诱导和配制

选健康雄性成年SD或Wistar大鼠，体重150g~200g，约5周龄~6周龄。将多氯联苯 (Aroclor1254)溶于玉米油中，浓度为200g／L，按500mg／kg体重无菌操作一次腹腔注射，5d后处死动物，处死前禁食12h。

也可采用苯巴比妥钠和β-萘黄酮联合诱导的方法进行制备，经口灌胃给予大鼠苯巴比妥钠和β-萘黄酮，剂量均为80mg／kg体重，连续3d，禁食16h后断头处死动物。其他操作同多氯联苯诱导。

处死动物后取出肝脏，称重后用新鲜冰冷的0．15mol／L氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝(湿重)加0．1mol／L氯化钾溶液3mL，连同烧杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器(低于4000r／min，1min~2min)或组织匀浆器(低于20000r／min，1min)中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。

将制成的肝匀浆在低温(0℃~4℃)高速离心机上以9000犵离心10min，吸出上