体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验.docx

中华人民共和国国家标准

犌B15193．12—2014

食品安全国家标准

体外哺乳类细胞H犌PRT基因突变试验

2014-12-24发布

2015-05-01实施

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会

发布

Ⅰ

犌B15193．12—2014

前言

本标准代替GB15193．12—2003《体外哺乳类细胞(V79／HGPRT)基因突变试验》。本标准与GB15193．12—2003相比，主要变化如下：

—标准名称修改为“食品安全国家标准体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验”；—增加了术语和定义；

—修改了试验目的和原理；

—增加了不同种类受试物的配制方法；

—增加了参考阳性对照物；

—增加了试验用细胞株。

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犌B15193．12—2014

食品安全国家标准

体外哺乳类细胞H犌PRT基因突变试验

1范围

本标准规定了体外哺乳类细胞次黄嘿岭鸟嘿岭磷酸核糖转移购(HGPRT)基因突变试验的基本试验方法和技术要求。

本标准适用于评价受试物的致突变作用。

2术语和定义

2．1H犌PRT基因

哺乳类动物的次黄嘿岭鸟嘿岭磷酸核糖转移购基因。在人类，HGPRT基因定位于X染色体的长臂，坐标为Xq26．1；在小鼠也定位于X染色体。

2．2突变频率

在某种细胞系中，某一特定基因突变型的细胞(集落)占细胞(集落)总数的百分率。3试验目的和原理

细胞在正常培养条件下，能够产生HGPRT，在含有6-硫代鸟嘿岭(6-thioguanine，6-TG)的选择性培养液中，HGPRT催化产生核昔-5′-单磷酸(NMP)，NMP掺入DNA中致细胞死亡。在致癌和(或)致突变物作用下，某些细胞X染色体上控制HGPRT的结构基因发生突变，不能再产生HGPRT，从而使突变细胞对6-TG具有抗性作用，能够在含有6-TG的选择性培养液中存活生长。

在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使细胞暴露于受试物一定时间，然后将细胞再传代培养，在含有6-TG的选择性培养液中，突变细胞可以继续分裂并形成集落。基于突变集落数，计算突变频率以评价受试物的致突变性。

4材料和试剂

4．1细胞

常用中国仓鼠肺细胞株(V79)和中国仓鼠卵巢细胞株(CHO)，其他如小鼠淋巴瘤细胞株(L5178Y)和人类淋巴母细胞株(TK6)亦可。细胞在使用前应进行有无支原体污染的检查。

4．2培养液

应根据试验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养基。对于V79和CHO细胞，常用最低必需培养基(MEM，Eagle)、改良Eagle培养基(DMEM)加入10％胎牛血清和适量抗菌素。对于TK6和L5178Y细胞，常用RPMI1640培养液，加入10％马血清(培养瓶培养)或20％马血清(96孔板培养)和适量抗菌素(青霉素、链霉素)。

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4．3胰蛋白繭／ED犜A溶液

用无钙、钱PBS配制，胰购的浓度为0．05％，EDTA的浓度为0．02％，胰蛋白购与EDTA溶液按1∶1混合。－20℃储存。

4．4活化系统

通常使用的是S9混合物。S9的制备方法如下：

选健康雄性成年SD或Wistar大鼠，体重150g~200g左右，周龄约5周~6周。将多氯联笨 (Aroclor1254)溶于玉米油中，浓度为200g／L，按500mg／kg体重无菌操作一次腹腔注射，5d后处死动物，处死前禁食12h。

也可采用笨巴比妥钠和β-茶黄卵联合诱导的方法进行制备，经口灌胃给予大鼠笨巴比妥钠和β-茶黄卵，剂量均为80mg／kg，连续3d，禁食16h后断头处死动物。其他操作同多氯联笨诱导。

处死动物后取出肝脏，称重后用新鲜冰冷的氯化钾溶液(0．15mol／L)连续冲洗肝脏数次，以便除去能抑制微粒体购活性的血红蛋白。每克肝(湿重)加氯化钾溶液(0．1mol／L)3mL，连同烧杯移入冰浴中，用无菌剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器(低于4000r／min，1min~2min)或组织匀浆器(低于20000r／min，1min)中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。

将制成的肝匀浆在低温(0℃~4℃)高速离心机上以9000g离心10min，吸出上清液为