实验微柱法分离测定糖化血红蛋白.ppt

一.目的要求

❖了解测定糖化血红蛋白的意义。

❖掌握微柱法测定糖化血红蛋白的原理和实验技术。

二．实验原理

❖葡萄糖可以和体内多种蛋白质中的氨基不可逆地以共价键

结合，这个过程不需要酶的参与，其反应速度主要取决于

葡萄糖的浓度。这种被葡萄糖糖化的蛋白主要存在于糖尿

病或其他高血糖患者中。糖化过程通常缓慢地进行，一旦

形成，不再解离。

❖对血糖或尿糖波动较大的患者来说，采用糖化蛋白来诊断

或追踪病情的发展具有独特的临床意义，它可以反映较长

时期以来的平均血糖浓度。

二．实验原理

❖临床上测定的糖化蛋白主要有糖化血红蛋白

(glycohemoglubin，GHb)和糖化血清蛋白(glycated

serumprotein，GSP)。

❖测定糖化蛋白的方法有比色法、电泳法、等电聚焦法、离

子交换层析法、高效液相层析法、亲和层析法、免疫化学

法、毛细管电泳法等。国内以比色法、离子交换层析法及

电泳法较常用。

二．实验原理

❖带负电荷的Bio-Rex70阳离子交换树脂与带正电荷的HbA

及HbAi有亲和力，但由于HbAi的两个链N-末端正电荷

被糖基清除，正电荷较HbA少，二者对树脂的亲和力不同。

用pH6.7磷酸盐缓冲液可首先将带正电荷较少、吸附力较

弱的HbA1洗脱下来，再用分光光度计测定洗脱液中的

HbA1占总Hb的百分数。

三．器材及试剂

1．器材：

（1）塑料微柱。

（2）紫外-可见分光光度计。

三．器材及试剂

2．试剂：

（1）0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取无水磷酸氢二钠28.369g，溶于

蒸馏水中并定容至1L。

（2）0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取NaH2PO42H2O31.206g，溶于

蒸馏水中并加1L。

（3）溶血剂：取试剂（2）25ml，加TritonX-100100mg，加蒸馏水

至100ml。

（4）磷酸盐缓冲液(pH6.7)：取试剂（1）100ml、试剂（2）150ml，

加蒸馏水至1L。

（5）磷酸盐缓冲液(pH6.4)：取试剂（1）300ml、试剂（2）700ml，

加蒸馏水300ml，混匀即成。

（6）Bio-Rex70阳离子交换树脂，200—400目，钠型，分析纯级。

四．操作步骤

1．树脂处理

称取树脂4g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液15ml，搅匀，置室温

30min，间隔搅拌2-3次。然后加浓盐酸数滴，调至pH6.7，弃去上

清液。用蒸馏水约25ml洗1次，再用试剂（5）10ml洗2次，最后用

试剂（4）洗4次即可。

2．装柱

树脂加试剂（4）搅匀，用毛细滴管加入塑料微柱内，使树脂

床高度达3-4cm即可，树脂床应均匀，无气泡、无断层才可。

3．血红蛋白溶液的制备

取EDTA抗凝血或毛细管血20L，加入2.0mL生理盐水中，摇

匀，2000rpm离心5分钟，弃上清液，仅留下细胞。加溶血剂0.3ml，

摇匀，置37℃水浴中15min，以除去不稳定的HbA1。

四．操作步骤

4．柱的准备

将微柱摇动使树脂混悬，然后去掉上下盖，将柱插入

1.5cmx15cm的试管中，让柱内缓冲液完全流出。

5．上样

用微量加样器取血红蛋白溶液100l，加至微柱内树脂床

上，待其完全进入树脂床后，将柱移入另一支1.5cmx15cm

的试管中。

6．洗脱

取试剂（4）3ml缓缓加至树脂床上，注意勿冲动树脂。

收集洗脱液，此即为HbA1（测定）。

四．操作步骤

7．对照

取上述血红蛋白溶液50L，加蒸馏水7.5ml，摇匀，此即

为总Hb管。

8．比色

以蒸馏水作空白，415nm波长，测定各管吸光度。

9．柱的清洗

用过的柱先加试剂（5）3ml，使Hb全部洗下，再用试剂

（4）洗3次，每次3ml。最后加试剂（4）3ml，加上下盖，

保存备用。

五．计算

测定管吸光度

HBA%=100%

1对照管吸光度5

参考值HbAl:6.590.69%

六．临床意义

❖糖化血红蛋白测定用于评定糖尿病的控制程度，当糖尿病

控制不佳时，糖化血红蛋白浓度可高至正常2倍以上。

❖因为糖化血红蛋白是血红蛋白生成后与糖类经非酶促结合

而成的。它的合成过程是缓慢的，而且是相对不可逆的，

持续于红细胞120天生命期中，其合成速率与红细胞所处

环境中糖的浓度成正比。

❖因此，糖化血红蛋白所占比率能反映测定前1-2个