骨髓间充质干细胞来源外泌体内miR-182-5p经内质网应激途径调控人激素性股骨头坏死成骨细胞凋亡的.pdfVIP

骨髓间充质干细胞来源外泌体内miR-182-5p经内质网应激途径调控人激

素性股骨头坏死成骨细胞凋亡的机制研究

摘要

背景：

分析前期基因测序研究结果，汇总了骨髓间充质干细胞（BMSCs）在股骨颈骨

折组和激素性股骨头坏死（SONFH）组的患者所差异表达的miRNA，我们还并通过

starBase数据库来预测了miR-182-5p与ATF6存在靶向关系，而ATF6相关通路是内

质网应激三个通路之一，因此考虑可能存在miR-182-5p/ATF6内质网应激信号调节轴。

本研究想要通过实验验证BMSCs来源外泌体内miR-182-5p可靶向ATF6通过内质网

应激对抗地塞米松诱导的成骨细胞凋亡。

一：BMSCs外泌体提取验证及miR-182-5p差异表达验证

方法：

（1）本实验所用骨髓是经患者的知情同意后，在股骨颈骨折和SONFH的髋关

节置换（THA）术中进行采集，经过全骨髓贴壁培育法分离BMSCs。在细胞传代培

养后，得到纯化的BMSCs。根据细胞状态及倍增时间，选取P3代细胞用于后续实验。

流式细胞仪检测阳性CD90、CD73和阴性CD45、CD34表达水平。通过外泌体快速

提取试剂盒提取BMSCs培养上清液中的外泌体，通过透射电子显微镜（TEM）来观

察外泌体的形态，纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测外泌体分布、浓度（绝对计数），

Westernblotting检测标志蛋白TSG101、CD63和CD9的表达。

（2）qRT-PCR，检测miR-182-5p在股骨颈骨折组和SONFH组BMSCs中的表

达，验证了基因测序的结果。

结果：

（1）流式细胞仪分析示，分离培养的细胞几乎不表达CD34和CD45，但表达

MSCs特异性表面抗原CD90和CD73，说明所培养细胞的纯度尚可，杂细胞较少，

可用于后续实验。

（2）纳米颗粒跟踪分析、透射电子显微镜示，30-160nm球形或杯形颗粒，

Westernblotting结果显示，外泌体标志蛋白CD9、CD63、TSG101表达阳性，进一步

验证了这些颗粒为外泌体。

（3）qRT-PCR结果显示，SONFH患者组较股骨颈骨折组的BMSCs中miR-

182-5p的表达明显降低。

结论：

miR-182-5p在SONFH患者BMSCs表达明显降低。

二：BMSCs外泌体内miR-182-5p调控地塞米松诱导的成骨细胞凋亡

方法：

（1）成骨细胞摄取外泌体实验，PKH26标记外泌体在成骨细胞中孵育，通过激

光共聚焦显微镜观察。

（2）hsa-miR-182-5pmimics转染BMSCs，并通过qRT-PCR技术检测BMSCs外

泌体miR-182-5p表达。

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（3）应用10mol/L地塞米松构建成骨细胞凋亡模型，在培养基中分别加入过表

达miR-182-5p外泌体和NC对照外泌体，并通过流式细胞术分析。

结果：

（1）荧光显微镜观察可见PKH26标记的外泌体在成骨细胞细胞质中显示红色荧

光，说明BMSCs外泌体可被成骨细胞摄取。

（2）qRT-PCR结果示，与NC组相比，转染过表达质粒后BMSCs外泌体内

miR-182-5p表达增加。

（3）流式细胞术结果分析显示，转染miR-182-5pmimics的BMSCs外泌体能够

抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡。

结论：

BMSCs外泌体miR-182-5p可抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡。

三：miR-182-5p与ATF6的靶向关系验证

方法：

通过构建双荧光素酶报告基因系统，来对miR-182-5p与ATF6进行匹配性验证，

明确miR-182-5p与ATF6的靶向结合位点。

结果：

转染ATF6-WT质粒组相对荧光值有明显的降低，表示miR-182-5p与ATF6间是

存在有靶向的结合。

结论：

成骨细