新型冠状病毒检测技术规范微量血清中和试验.docxVIP

新型冠状病毒检测技术规范微量血清中和试验

试验准备

试剂准备

1.新型冠状病毒活病毒：应选择合适滴度的病毒株，需在特定等级生物安全实验室进行操作。病毒工作液的制备要准确稀释至合适的使用浓度。

2.细胞培养液：常用DMEM、RPMI1640等，添加10%胎牛血清、青霉素-链霉素等双抗以维持细胞生长和防止污染，其pH值要调节至合适范围（一般为7.2-7.4）。

3.阳性对照血清和阴性对照血清：阳性对照血清来源于经病毒感染康复且抗体检测呈阳性的个体，阴性对照血清来自未感染且抗体检测阴性的个体，都要经过严格的质量检测。

4.胰酶：用于消化贴壁细胞，使其从培养瓶壁上脱离，要注意保存条件和有效期。

5.二甲基亚砜（DMSO）：在细胞冻存时使用，其纯度要符合实验要求。

耗材准备

1.96孔细胞培养板：用于加样和细胞培养，要选择无菌、透明度好的产品。

2.移液器及吸头：不同量程的移液器要校准准确，吸头为一次性无菌制品。

3.细胞培养瓶：常用T25、T75规格，用于细胞的扩大培养，需清洗干净并经过高温高压灭菌。

4.冻存管：用于细胞的冻存，要耐低温且密封性好。

5.注射器和针头：用于病毒液的吸取和转移，针头规格根据实验需求选择。

仪器准备

1.生物安全柜：提供一个无菌、安全的操作环境，要定期进行清洁和消毒，检测其空气质量。

2.二氧化碳培养箱：维持细胞生长所需的温度（37℃）、二氧化碳浓度（5%）和湿度，要经常检查各项参数的稳定性。

3.离心机：用于细胞的离心收集，转速和时间要根据细胞类型准确设置。

4.倒置显微镜：用于观察细胞的形态和生长状况，要保持镜头的清洁。

5.酶标仪：用于检测细胞病变的程度，要定期进行校准和维护。

细胞培养

1.复苏细胞：从液氮中取出冻存的细胞，迅速放入37℃水浴锅中快速解冻。将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，加入适量培养液，1000rpm离心5分钟，弃上清。用含10%胎牛血清的培养液重悬细胞，转移至细胞培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。

2.传代培养：当细胞生长至融合度达到80%-90%时，弃去原培养液，用PBS冲洗细胞2次。加入适量胰酶，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，在显微镜下观察细胞形态变圆并开始脱离瓶壁时，加入等量含血清培养液终止消化。将细胞悬液转移至离心管，1000rpm离心5分钟，弃上清，用新鲜培养液重悬细胞，按1:3或1:4的比例传代至新的培养瓶中继续培养。

3.细胞铺板：将培养好的细胞用胰酶消化后，制成细胞悬液，用移液器将细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔加入100μL，使每孔细胞数量达到合适范围（一般为1×10?-3×10?个）。将培养板置于二氧化碳培养箱中培养24小时，使细胞贴壁生长。

血清样本处理

1.血清分离：采集血液样本后，室温放置30分钟使其自然凝固，然后3000rpm离心15分钟，分离出血清。将血清转移至新的离心管中，避免混入血细胞。

2.灭能处理：将分离好的血清置于56℃水浴锅中加热30分钟，以灭活补体等成分，防止其对中和试验结果产生干扰。灭能后的血清可在-20℃冰箱中保存备用。

血清稀释和病毒中和

1.血清稀释：在96孔细胞培养板上进行血清稀释。先将待检血清按倍比稀释法从起始浓度（如1:10）开始稀释，一般可稀释至1:1280或更高。用移液器吸取50μL不同稀释度的血清到相应的孔中，每个稀释度设置2-3个复孔。

2.病毒加入：将预先制备好的适量病毒工作液（一般含100TCID??）加入到含有不同稀释度血清的孔中，每孔加入50μL，轻轻混匀。同时设置阳性对照孔（加入阳性对照血清和病毒）、阴性对照孔（加入阴性对照血清和病毒）和病毒对照孔（只加入病毒，不加血清）以及细胞对照孔（只加细胞，不加病毒和血清）。

3.中和孵育：将加样后的培养板置于37℃二氧化碳培养箱中孵育1-2小时，使病毒与血清中的抗体充分反应。

接种细胞

孵育结束后，从二氧化碳培养箱中取出培养板，每孔加入100μL细胞悬液（含适量细胞），继续放入二氧化碳培养箱中培养。培养期间，每天在倒置显微镜下观察细胞病变（CPE）情况。

结果观察和判定

1.观察时间：一般在接种细胞后3-7天进行结果观察，以出现典型细胞病变为准。

2.观察指标：正常细胞形态完整、贴壁良好，而感染病毒的细胞会出现变圆、脱落等病变现象。

3.判定标准：以能完全抑制50%细胞孔出现细胞病变的血清最高稀释度作为该血清的中和抗体滴度。具体计算可采用Reed-Muench法或Karber法。