分子克隆工具酶课件.pptVIP

3.T4DNA聚合酶(T4phageDNApolymerase)（1）T4DNA酶的基本特性：有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性。在無dNTP時，可以從任何3`-OH端外切－在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸。－在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導地位。（2）基本用途4.反轉錄酶(reversetranscriptase)反轉錄酶具有5′→3′的DNA聚合酶活性，以RNA為範本聚合cDNA鏈,同時又具有3′→5′和5′→3′的RNA外切核酸酶活性。AMV和MLV。雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈（二）DNA連接酶(DNAligase)DNA連接酶能催化雙鏈DNA切口處的5′-磷酸根和3′-羥基生成磷酸二酯鍵。這種反應需要供給能量，大腸桿菌和其他細菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來源，動物細胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來源。1、T4DNA連接酶的作用機制：①ATP+DNAligase(E)→E-AMP+PPi。②E-AMP上的AMP轉移到DNA的5′磷酸根上，使其活化，釋放出酶。③活化的5′磷酸根與相鄰的3′羥基形成3′，5′－磷酸二酯鍵，並釋放出AMP。修復雙鏈DNA缺口處的磷酸二酯鍵修復與RNA結合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵連接多個平頭雙鏈DNA分子：*分子克隆工具酶在過去20多年裏，生物科學取得的許多革命性進步都直接來源於對基因的進一步認識和操作。基因操作或遺傳工程的主要工具就是那些可在DNA分子上催化特異性反應的酶。酶的切割位點可作為DNA物理圖的特殊標記，利用限制性內切酶可產生特定大小的DNA片段並使純化這些DNA片段成為可能，獲得的限制性DNA片段可作為DNA操作中的基本介質。對DNA進行修飾的工具的出現，為重組DNA的實現創造了條件一限制性內切酶（一）寄主的限制與修飾現象限制(restriction)：指一定類型的細菌可以通過限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導致噬菌體的寄主幅度受到限制。限制作用:實際就是限制性內切酶降解外源DNA，維護宿主遺傳穩定的保護機制。修飾(modification)：指寄主本身的DNA，由於在合成後通過甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修飾,從而免遭自身限制性酶的破壞。修飾作用:宿主細胞通過甲基化作用達到識別自身遺傳物質和外來遺傳物質的目的。（二）限制性核酸內切酶(restrictionednonuclease)1.限制性核酸內切酶的概念是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，並由此切割DNA雙鏈結構的核酸水解酶。2006年2月共發現3773種限制性內切酶，I、II、III型各有68、3692、10種，甲基化指導的3種,商品化的609種,II型中共有223種特異性。2.限制性核酸內切酶的命名原則1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原則，1980年Roberts在此基礎上進行了系統分類①限制性核酸內切酶第一個字母（大寫，斜體）代表該酶的宿主菌屬名(genus);第二、三個字母(小寫，斜體)代表宿主菌種名(species)。②第四個字母代表宿主菌的株或型(strain)。③若從一種菌株中發現了幾種限制性核酸內切酶，即根據發現和分離的先後順序用羅馬字母表示。限制性核酸內切酶的命名原則：屬名種名株名Haemophilusinfluenzaed流感嗜血桿菌d株HindⅡHindⅢ同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內切酶3.限制性核酸內切酶的分類據限制性核酸內切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三類。主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修飾蛋白結構輔助因數識別序列切割位點多功能異源三聚體ATPMg2+SAM距識別序列1kb處隨機性切割單功能同源三聚體Mg2+4-6bp回文序列識別序列內或附近特異切割雙功能異源二聚體ATPMg2+距識別序列下游24-26bp處隨機性切割4.Ⅱ限制性核酸內切酶的功能Ⅱ限制性核酸內切酶有嚴格的識別、切割順序，它以核酸內切方式水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵，產生的DNA片段5′端為P，3′端為OH，識別序列一般為4～6個堿基對，通常是反轉錄重複順序，具有180°的旋轉對稱性即迴文結構。Ⅱ限制性核酸內切酶切割雙鏈DNA產生3種不同的切口。5.II型限制性核酸內切酶酶切反應操作◆大部分II型限制性核酸內切酶需要相似反應條件：Tris-HCl50m