核酸分子杂交课件.pptVIP

㈢非放射性核酸探針的檢測非放射性同位素標記的探針，除酶直接標記探針外，其他非放射性標記物並不能被直接檢測，需先將非放射性標記物與檢測系統偶聯，再顯色。⒈偶聯反應：大多數非放射性標記物是半抗原(如地高辛)，因此可以通過抗原抗體反應系統與顯色體系偶聯：Dig-DNA探針+抗Dig抗體-鹼性磷酸酶(或辣根過氧化物酶)+底物(BCIP和NBT)；生物素可與抗生物素蛋白(卵白素，avidin)或鏈親合素(streptavidin)結合，再與顯色體系相偶聯。⒉顯色反應：通過連接在抗體或抗生物素蛋白上的顯色物質(如酶、螢光素等)進行雜交信號的檢測。鹼性磷酸酶可使其底物BCIP脫磷並聚合，在此過程中釋放出的氫可使NBT(四氮唑藍)還原而形成紫色的化合物(圖7-7)。第三節核酸分子雜交技術在液體中進行雜交反應稱為液相雜交；在固相支持物上進行雜交則稱為固相雜交。固相雜交包括膜上印跡雜交和細胞原位雜交兩類。固相雜交是印跡技術及雜交信號檢測技術等相結合，從而獲得清晰的雜交圖譜，有利於定性或定量分析待測核酸樣品中的特定片段(靶序列)，在核酸的結構和功能研究以及基因工程研究中，其應用比液相雜交更為廣泛，其技術發展也更為迅速。一、膜上印跡雜交膜上印跡雜交是指將待測核酸序列結合到一定的支持物上，然後與存在於液相中的核酸探針進行雜交的過程，是目前最常用的一種核酸分子雜交方法。㈠濾膜雜交的基本過程如圖7-8所示。(1)?????核酸的製備(2)?????電泳(3)?????印跡(4)?????預雜交(5)?????雜交(6)?????洗膜(7)?????檢測㈡固相支持物的選擇一種良好的固相支持物應具備以下幾個特點：(1)?????具有較強的結合核酸分子的能力，一(2)?????與核酸分子結合後應不影響其與探針分子的雜交反應。(3)?????與核酸分子的結合穩定牢固，(4)?????非特異性吸附少。(5)?????具有良好的機械性能。下麵介紹幾種常用的固相支持物：(1)??硝酸纖維素膜：特別適用於蛋白質(如抗體和酶等)的非放射性標記探針的雜交體系。(2)?尼龍膜(nylonmembrane)：尼龍膜結合單鏈及雙鏈DNA和RNA的能力較硝酸纖維素膜更強，耐堿處理適合於一步法的菌落原位印跡法。尼龍膜的缺點是不宜使用非同位素探針，即使用各種蛋白(如BSA、牛奶等)進行預雜交，產生的雜交信號本底較高，與非特異吸附有關。PVDF膜：比尼龍膜結合力更強，且在預雜交中很容易被封閉，使用同位素和非同位素探針都可產生較淺的本底，而且結實耐用，可以多次雜交。㈢印跡方法⒈虹吸印跡法(圖7-9)利用毛細管的虹吸作用由轉移緩衝液帶動核酸分子轉移至濾膜上。⒉真空轉移法(圖7-10)其原理是利用真空泵將轉移緩衝液從上層容器中通過凝膠抽到下層真空室中，同時帶動核酸分子轉移到凝膠下麵的濾膜上。該法的最大優點是快速，轉膜的同時進行DNA的變性和中和，整個過程只需1h左右。核酸分子雜交核酸分子雜交是指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基互補配對原則退火形成異質雙鏈的過程,即來源不同的兩條單鏈核酸分子通過堿基互補可形成異源雙螺旋，稱為核酸分子雜交(hybridization)。具有靈敏度高、特異性強等優點，主要用於特異DNA或RNA的定性、定量檢測。第一節???核酸分子雜交的基本原理DNA和DNA鏈、RNA與DNA鏈或兩條RNA鏈之間，只要具有一定的互補序列均可在適當的條件下發生雜交。常用已知的DNA或RNA的片段作為探針，包括特異的DNA序列，或轉錄的RNA序列或cDNA序列，或人工合成的寡核苷酸片段。根據支持物的不同，分為固相雜交和液相雜交。固相雜交又包括膜上印跡雜交和細胞原位雜交兩種。膜上印跡雜交即將核酸從細胞中分離純化後，在體外與探針雜交，細胞原位雜交是在細胞內進行的雜交。一、雜交的穩定性（表7-1）Tm是核酸雙鏈解鏈成單鏈過程中，其克原子消光係數?(P)值的增加達到最高值一半時的溫度。不同雜交雙鏈其Tm值不同，影響因素有：(1)雜交鏈GC含量愈高的雜交雙鏈其Tm值愈高。(2)?雜交鏈愈長其Tm值愈高。(3)?雜交雙鏈的堿基錯配程度。(4)?溶液的離子強度越大，Tm值愈高。變性劑可影響堿基堆積力和氫鍵的形成，可降低Tm值，常用甲醯胺、脲及二甲基亞碸等。用50%的甲醯胺大約可使雜交雙鏈的Tm值降低30℃。二、雜交動力學雜交過程的第一步是兩條核酸單鏈隨機碰撞