丝状真菌高通量培养与筛选技术研究.pdfVIP

摘要

丝状真菌是常用的工业菌株，在酸、酶、抗生素等次级代谢产物的发酵生产中应

用极其广泛。近年来，针对丝状真菌的基因改造取得极大发展，尤其是CRISPR技术

的广泛研究，使得基因水平的改造已经不再是限制因素。但是由于丝状真菌具有极强

的繁殖能力，并且菌丝粗而长，还会产生极难灭活的孢子，因此，如何从进行基因改

造后产生的大量不同性状的菌株中筛选出想要的目标菌株成为丝状真菌的菌株改造

中非常棘手的问题。目前使用的筛选方法主要还是进行平板后进行验证，这种方式往

往工作量巨大，通量低，而且在验证过程中非常容易遗漏部分菌株。本研究分别使用

孔板和液滴微流控两种高通量方式对丝状真菌的培养、筛选进行尝试，以期望建立丝

状真菌的高通量培养、筛选方法。

Myceliophthorathermophila

本工作首先对孔板培养嗜热毁丝霉（）为例的丝状真菌过

程中的快速高通量制种、单分散孢子制备孔板液体培养、产物快速检测等各个环节展

开针对性的研究，简化了制种步骤，将制种通量提高24倍，以更简便快捷的方式获

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得干净的单分散孢子，液体培养转接效率提高倍，并建立了乙醇的孔板式高通量

检测技术。

在此基础上，为了实现丝状真菌的超高通量的筛选方法的建立，本工作对液滴微

流控中液滴状态及尺寸进行改进。首先研究了以海藻酸钠为材料的凝胶液滴的生成条

件，固化条件以及分选条件，得到大小均匀，单独分散的固体凝胶液滴，并成功分选

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出具有荧光的液滴，理论筛选通量可达7x10个/h。此外研究了纳升级液滴的生成条

件，观察方式以及分选条件，解决了纳升级液滴显微观察困难的问题，并区分出含有

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荧光的液滴，理论筛选通量达到2.4x10个/h。

本研究针建立了丝状真菌的高通量孔板培养方法，将丝状真菌的菌株培养和检测

验证通量大幅提高。另一方面对芯片液滴的状态及大小进行有效改进，虽然未能成功

应用于黑曲霉（Aspergillusniger）为例的丝状真菌的超高通量的培养，但为生产次级

代谢产物的丝状真菌筛选工作提供应用指导价值。

关键词：丝状真菌；孔板培养；高通量筛选；液滴微流控；凝胶液滴

ABSTRACT

Filamentousfungiarecommonlyusedindustrialstrains,whicharewidelyusedinthe

fermentationofsecondarymetabolitessuchasacids,enzymes,antibioticsandsoon.In

recentyears,thegeneticmodificationoffilamentousfungihasmadegreatprogress,

especiallytheextensiveresearchofCRISPRtechnology,sothatgeneticmodificationisno

longeralimitingfactor.However,becausefilamentousfungihavetheextremelystrong

reproductiveability,andthehyphaearethickandlong,theywillproducesporesthatare

extremelydifficulttoinactivate,therefore,howtoselectthedesiredtargetstrainfroma

largenumberofstrainsofdifferentshapesproducedaftergeneticmodificationisavery

thornyprobleminthetransformationoffilamentousfungi.Atpresent,themainscreening

methodistoverifyaftertheplate