基因结构与功能分析技术课件.pptVIP

（二）用PCR技術檢測RNA表達水準1.用逆轉錄PCR進行RNA的半定量分析逆轉錄PCR（RT-PCR）一般用於RNA的定性分析；如果設置陽性參照，則可對待測RNA樣品進行半定量分析。2.用即時定量PCR進行RNA的定量分析即時定量PCR是定量分析RNA的最通用、最快速、最簡便的方法，該方法是對PCR反應進行即時監測，具有很高的靈敏度和特異性。（三）用基因晶片和高通量測序技術分析RNA表達水準1.基因晶片已成為基因表達譜分析的常用方法基因晶片主要採用cDNA晶片，其便於對不同狀態下的基因表達譜進行比較，揭示轉錄組差異表達的規律，對探索發病機制、評價治療效果、篩選藥物靶標具有重要意義。2.用迴圈晶片測序技術分析基因表達譜運用迴圈晶片測序技術，可對基因表達譜進行高通量分析，一次可完成幾十萬到幾百萬個DNA分子片段的序列測定，從而快速獲得轉錄組或基因組的全貌。二、通過檢測蛋白質/多肽而在翻譯水準分析基因表達（一）用蛋白質印跡技術檢測蛋白質/多肽（二）用酶聯免疫吸附實驗分析蛋白質/多肽酶聯免疫吸附實驗（ELISA）也是一種建立在抗原-抗體反應基礎上的蛋白質/多肽分析方法，其主要用於測定可溶性抗原或抗體，（三）用免疫組化實驗原位檢測組織/細胞表達的蛋白質/多肽免疫組化實驗包括免疫組織化學和免疫細胞化學實驗，二者原理相同，都是用標記的抗體在組織/細胞原位對目標抗原（目標蛋白質/多肽）進行定性、定量、定位檢測。（四）用流式細胞術分析表達特異蛋白質的陽性細胞流式細胞術（flowcytometry）通常利用螢光標記抗體與抗原的特異性結合，經流式細胞儀分析螢光信號，根據細胞表達特定蛋白質的水準對某種蛋白質陽性細胞做出判斷。（五）用蛋白質晶片和雙向電泳高通量分析蛋白質/多肽表達水準1.用蛋白質晶片分析蛋白質/多肽的表達譜根據製作方法和用途不同，可將其分為蛋白質檢測和功能晶片兩大類。蛋白質檢測晶片包括抗體晶片、抗原晶片、配體晶片等，它是將具有高親和力的特異性探針分子固定在基片上，用以識別生物樣品溶液中的目標多肽；蛋白質功能晶片可用來研究蛋白質修飾、蛋白質-蛋白質∕蛋白質-DNA∕蛋白質-RNA，以及蛋白質與脂質、蛋白質與藥物、酶與底物、蛋白質-小分子等的相互作用。目录目录基因結構與功能分析技術TheAnalysisTechnologyforGeneStructureandFunction人類的多種疾病都與基因的結構或功能異常有關，因此，要闡明疾病發生的分子機制和進行有效的診斷與防治，均需首先揭示基因的結構與功能。DNA序列測定基因轉錄起點及其啟動子的分析基因編碼序列的分析基因拷貝數及其表達產物的分析基因功能獲得和/或缺失策略隨機突變篩選策略第一節基因結構分析技術一、基因一級結構解析技術基因的一級結構是指去氧核苷酸的排列順序，解析一級結構最精確的技術就是DNA測序（DNAsequencing）。（一）雙去氧法和化學降解法是兩種常規的DNA測序方法Sanger雙去氧測序（dideoxysequencing）法Maxam-Gilbert化學降解測序法（二）全自動鐳射螢光DNA測序技術的原理基於Sanger雙去氧法1.四色螢光法：採用四種不同的螢光染料標記同一引物或4種不同的終止底物ddNTP，最終結果均相當於賦予DNA片段4種不同的顏色。因此，一個樣品的4個反應產物可在同一個泳道內電泳。2.單色螢光法：採用單一螢光染料標記引物5′-端或dNTP，所有產物的5′-末端均帶上了同一種螢光標記，一個樣品的四個反應必須分別進行，相應產物也必須在四個不同的泳道內電泳（三）焦磷酸測序是一種基於發光法測定焦磷酸的測序技術焦磷酸測序技術操作簡單，結果準確可靠，可應用於單核苷酸多態性位點（SNP）分析、等位基因頻率測定、細菌和病毒等微生物的分型鑒定、CpG甲基化分析、掃描與疾病相關基因序列中的突變點等領域。該方法的測序長度一般短於Sanger法。（四）迴圈晶片測序被稱為第二代測序技術迴圈晶片測序（cyclic-arraysequencing）①可實現大規模並行化分析②不需電泳，設備易於微型化③樣本和試劑的消耗量降低，降低了測序成本優勢：技術平臺：454測序、Solexa測序（Illumina測序）、SOLiD測序等。基本流程：①將基因組DNA隨機切割成為小片段DNA；②在所獲小片段DNA分子的末端連上接頭，然後變性得到單鏈範本文庫；③將帶接頭的單鏈小片段DNA文庫固定於固體表面；④對固定片段進行克隆擴增，從而製成polony晶片