核酸的研究方法课件.pptVIP

末端終止法——Sanger2’，3’雙去氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成鏈延伸的抑制劑。MOV:MCB4.0\DideoxysequencingofDNADNA序列分析儀：四色螢光基團標記的dNTP（二）DNA的化學法測序：由Maxam和Gilbert所發明。其基本原理是用特異的化學試劑作用於DNA分子中的不同堿基，然後用呱啶切斷反應堿基的多核苷酸鏈。用4組不同的特異反應，可使末端標記的DNA分子切成不同長度的片斷，其末端都是該特異的堿基。經變性膠電泳和放射自顯影得到測序圖譜4組特異的反應如下：（1）G反應：用硫酸二甲酯DMS使鳥嘌呤上的N7原子甲基化，加熱引起鳥嘌呤脫落，多核苷酸鏈可在此處斷裂（2）G+A反應：用甲酸使A和G嘌呤環上的N原子質子化，從而使其糖苷鍵變得不穩定，再用呱啶使鍵斷裂（3）T+C反應：用肼使T和C的嘧啶環斷裂，再用呱啶除去堿基（4）C反應：當有鹽存在時，只有C與肼反應，並被呱啶除去。嘧啶使修飾堿基脫落，並使去掉堿基的磷酸二酯鍵斷裂32P-GCTACGTA：在A處：32P-GCT和32P-GCTACGT在G處：32p，32p-GCTAC在C處：32P-G和32P-GCTA在T處：32P-GC和32P-GCTACG硫酸二甲酯（G）：*ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸（G+A）：*A*ACTTCG*ACTTCGA*ACTTCGACA*ACTTCGACAG肼/Nacl（C）：*AC*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG肼（C+T）：*AC*ACT*ACTT*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG從下往上讀：CTACGTA，末端G不能讀出。32P*ACTTCGACAG*核酸的研究方法製備天然核酸必需採用溫和的條件，防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分離、提純和定量測定真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶於水或高鹽溶液（1mol/LNaCl），但不溶於低鹽溶液（0.14mol/LNaCl去除蛋白質：水飽和酚，氯仿異戊醇。DNA沉澱：0.3MNaAC-70%乙醇（一）DNA分離純化製備RNA時，最重要的是使RNase滅活：①所有容器都要經過高溫處理，不能高溫高壓的用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）處理。②加入強變性劑（如胍鹽）使RNase失活；③在RNA的反應體系內加入RNase的抑制劑（如RNasin)（二）RNA的分離（三）核酸含量的測定2、定糖法RNA：核糖→糠醛→→綠色物質（670-680nm）DNA：去氧核糖+二苯胺→蘭色物質（595-620nm）苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸1、紫外吸收法1個A～50μg/ml雙鏈DNA～40μg/mlRNA或單鏈DNA3、定磷法核酸含磷量為9.5%1g磷相當於10.5g核酸4、瓊脂糖凝膠電泳溴乙錠能插入DNA分子的堿基對間形成複合物在紫外線照射下溴乙錠發橘紅色螢光螢光強度與DNA含量成正比純DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染純RNA比值2.0，2.0DNA、Pr、苯酚污染（四）、核酸純度的測定OD260／OD280二、核酸的沉降特性與超速離心不同構象的核酸（線形、環形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度離心可以將不同構象DNA、RNA與蛋白質區分開來8MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml平衡時：浮力密度=CsCl密度=離心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10-10ρ：浮力密度ω：角速度（弧度/秒）r：樣品到轉軸的距離（一）核酸密度的測定G-C含量與DNA的浮力密度之間呈正比關係ρ=0.1xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10（二）測定DNA的G-C含量RNA＞DNA變性DNA＞雙鏈DNA＞蛋白質，變性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的構象（四）用於核酸的製備超螺旋DNA或用於大片段DNA的分離，精度低，但分離範圍廣。三、核酸的凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳用於小片段DNA的分析相對分子品質小於1000bp的DNA片斷和RNA的電泳。PAGE中一般不含RNase，用於