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金花茶查尔酮异构酶CnCHI调控类黄酮代谢的分子机理

摘要

金花茶（Camellianitidissima）是山茶科山茶属植物，其花色金黄、花瓣蜡质，具有

极高的观赏价值，被誉为“茶族皇后”、“植物界的大熊猫”。同时，金花茶富含类黄酮等

多种生物活性物质，具有极高的医疗保健价值。查尔酮异构酶（CHI）是植物类黄酮代

谢途径的关键酶，能够催化柚皮素查尔酮产生柚皮素，为下游各种黄酮类物质的生物合

成提供底物。因此，CHI在类黄酮生物合成中起着至关重要的作用，本文从金花茶查尔

酮异构酶CnCHIs入手，揭示其在金花茶类黄酮代谢中的作用，并初步解析其调控机理，

为高类黄酮含量的金花茶新品种培育提供理论依据。主要研究内容与结果如下：

1.利用金花茶三代全长转录组数据，对CnCHIs基因家族进行分析鉴定，共鉴定到

了7个CHI基因家族成员。进化树和多序列比对分析表明，CnCHI可分为三个亚家族，

Ⅰ型（CnCHI2/3/4）、Ⅲ型（CnCHI5/6/7）和Ⅳ型（CnCHI1）。转录组数据表明Ⅰ型查尔酮

异构酶CnCHI4和Ⅳ型查尔酮异构酶CnCHI1在金花茶花朵不同发育时期和不同组织中

的表达量明显高于其他成员，推测CnCHI1和CnCHI4可能在金花茶类黄酮代谢中发挥

关键作用。

2.对Ⅰ型查尔酮异构酶CnCHI4基因进行克隆并开展功能分析。表达模式分析表明

CnCHI4在金花茶花朵发育早期高表达，并且在根和茎中表达量较高。亚细胞定位结果

表明CnCHI4定位在细胞核和细胞膜。在烟草中过表达CnCHI4能够显著提高烟草叶片

中总黄酮含量。同时，将CnCHI4在金花茶叶片中进行瞬时过表达，瞬时过表达CnCHI4

后金花茶叶片中总黄酮含量得到明显提升。使用原核表达系统对CnCHI4蛋白进行重组

表达，体外酶活实验表明CnCHI4具有催化柚皮素查尔酮生成柚皮素的能力。

3.对CnCHI4的上游调控因子进行研究。克隆CnCHI4的启动子片段并将其构建到

pHIS2载体中进行酵母单杂交文库筛选。酵母单杂交实验表明CnRAP2-3能够与CnCHI4

启动子互作，但双荧光素酶报告基因实验表明CnRAP2-3并不能对CnCHI4基因的启动

子活性产生明显影响，猜测CnRAP2-3对CnCHI4的调控作用可能需要其他蛋白的介导。

同时，基于转录组数据对CnCHI4的上游调控因子进行鉴定，鉴定到一些可能参与调控

CnCHI4的关键转录因子。酵母单杂交及双荧光素酶报告基因实验表明CnMYB7能够与

CnCHI4的启动子结合并抑制其转录活性。氨基酸序列比对及进化树分析表明CnMYB7

属于第四亚族R2R3-MYB家族成员，具有转录抑制结构域，亚细胞定位结果表明

CnMYB7定位于细胞核中。在烟草中过表达CnMYB7导致烟草叶片萎缩变小，叶表面

皱缩；并抑制了苯丙烷、木质素及类黄酮代谢途径中相关基因表达，显著降低了转基因

烟草叶片的总黄酮含量。最后，在金花茶叶片中瞬时过表达CnMYB7，金花茶中苯丙烷、

木质素及类黄酮代谢途径相关基因呈现一定程度的下调表达，进一步明确了CnMYB7在

金花茶次生代谢过程中的作用。

4.对金花茶中Ⅳ型查尔酮异构酶CnCHI1进行克隆并开展功能研究。CnCHI1与

CnCHI4在表达模式上存在一定的相似性，都在金花茶花发育的早期高表达，但CnCHI1

在萼片中有明显的高表达。亚细胞定位结果表明CnCHI1定位于细胞核和细胞膜。在烟

草和金花茶叶片中过表达CnCHI1均明显促进了类黄酮的生物合成。原核表达及体外酶

活实验表明CnCHI1不存在查尔酮异构酶的催化活性，不能催化柚皮素查尔酮生成柚皮

素。研究表明Ⅳ型查尔酮异构酶参与类黄酮生物合成是通过与查尔酮合酶（CHS）互作

来实现的，因此我们克隆了金花茶查尔酮合酶基因CnCHS，酵母双杂交及双分子荧光互

补（BIFC）实验表明CnCHI1可与CnCHS互作。体外酶活实验表明当CnCHI1存在时，

CnCHS能够催化丙二酰辅酶A和对香豆酰辅酶A生成更多的柚皮素，同时减少了副产

物的生成。因此，在金花茶中Ⅳ型查尔酮异构酶CnCHI1可通过与CnCHS互作来参与

类黄酮的生物合成。

关键词：金花茶，类黄酮，查尔酮异构酶，MYB转录因子

Rolesofchalconeisomerase