电泳技术及其在分子生物学中的应用.pptVIP

在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，同时，在强还原剂（beta-巯基乙醇）作用下，使半胱氨酸之间的二硫键断裂。蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合(多肽和SDS的质量比为1:1.4)，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同分子之间原有的电荷差异。第29页，共53页，星期日，2025年，2月5日蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成比例。因此，蛋白质-SDS复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质亚基分子量的大小。当蛋白质分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。第30页，共53页，星期日，2025年，2月5日特点大多在不连续缓冲体系中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液；不连续缓冲体系具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故提高了SDS的分辨力；系统中所有组分都含有0.1%的SDS。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）第31页，共53页，星期日，2025年，2月5日负极积层胶分离胶加样孔正极第32页，共53页，星期日，2025年，2月5日配置积层胶分离胶丙烯酰胺浓度5%10-15%Tris-HCl1M，PH=6.81.5M，PH=8.8SDS，过硫酸铵，TEMED浓度相同电泳积层胶分离胶电压80V120VTris-HCl-甘氨酸电泳缓冲液(pH8.3)在凝胶中的电离情况甘氨酸→带负电的蛋白质亚基→Cl-带负电的蛋白质亚基→甘氨酸-→Cl-被分离蛋白质亚基的电离情况蛋白质亚基由于甘氨酸的挤压作用，在积层胶不被分离，而是被浓缩为最小体积蛋白质亚基在分离胶根据分子量的大小被分离第33页，共53页，星期日，2025年，2月5日考马斯亮蓝染色(0.1-1.0ug的多肽)第34页，共53页，星期日，2025年，2月5日One-DimensionalSDS第35页，共53页，星期日，2025年，2月5日IsoelectricFocusing(IEF)第36页，共53页，星期日，2025年，2月5日等电聚焦电泳的过程电泳时可将样品置于凝胶的任何位置；初始位置在负极时，因pH＞pI，蛋白质分子带负电，电泳时向正极移动；移动过程中，pH逐渐下降，所带负电荷量逐渐减少，蛋白质移动速度减慢；当移动到pH=pI时，蛋白质所带净电荷为零，蛋白质即停止移动；各种不同蛋白质在电泳结束后，会分别聚集于相应的等电点位置，形成一个很窄的区带；区带的位置是由pH梯度的分布和蛋白质的pI所决定，而与蛋白质分子的大小和形状无关。第37页，共53页，星期日，2025年，2月5日Two-DimensionalSDS第38页，共53页，星期日，2025年，2月5日第1页，共53页，星期日，2025年，2月5日电泳是带电荷的胶体颗粒在电场中的移动。净电荷：生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒形式分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度与其他大分子的相互作用。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号。电泳的实现还依赖于支持介质的存在。电泳的三要素第2页，共53页，星期日，2025年，2月5日以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳 （agrosegelelectrophoresis）聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）凝胶电泳用于分离、鉴定和纯化DNA片段第3页，共53页，星期日，2025年，2月5日重点内容影响DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素有哪些？Westernblotting的基本实验步骤,及每一步的操作意义.第4页，共53页，星期日，2025年，2月5日琼脂糖凝胶电泳第5页，共53页，星期日，2025年，2月5日琼脂糖（agarose）是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成