玉米浆对产黑色素短梗霉合成聚苹果酸机理研究.pdfVIP

摘要

聚苹果酸是一种新型的高分子聚合物材料，在医疗、环保、材料等领域被广

泛研究及应用，但产黑色素短梗霉作为一种非模式生物其整体代谢网络和与聚苹

果酸合成的代谢途径还未完全分析透彻，因此聚苹果酸合成机理仍需要进一步探

究。

AureobasidiummelanogenumBCSW-001

本文以产黑色素短梗霉（）作为出发

poly-malicacidPMLA

菌株，研究玉米浆对产黑色素短梗霉合成聚苹果酸（，）的

影响，首先，单因素试验和人工神经网络建模寻优得到发酵培养基最佳配比，在

发酵罐上放大验证，最后，通过转录组学与代谢组学对产黑色素短梗霉发酵产聚

苹果酸过程中基因和胞内代谢物的变化进行分析，并通过PEG介导转化的同源

重组技术对关键基因进行敲除验证。研究内容如下：

1

（）通过摇床水平单因素实验逐一优化玉米浆、蔗糖、蛋白胨、碳酸钙等

BB

培养基中主要成分的添加量，最后通过实验设计和人工神经网络建模寻优得

到最佳发酵培养基配比，同时设计对比实验验证培养基中玉米浆成分对产黑色素

短梗霉的PMLA产量的影响，并且发现玉米浆总含氮量是影响添加玉米浆促进

PMLA5LPMLA

合成的主要因素。发酵罐实验发现，添加玉米浆后，产量提升

43.4%。

25L

（）为研究玉米浆对于菌体合成聚苹果酸基因表达的影响，在发酵罐

48h时取样进行转录组学分析，通过生物信息学手段对转录组数据组装后进行无

参转录组比对，同时对实验组与空白组的差异基因进行分析，结果发现与聚苹果

β-

酸合成相关的差异基因主要集中在糖酵解途、脂肪的氧化途径、乙醇代谢路径

以及TCA循环和尿素循环等途径上，由此推测添加玉米浆后提高了产黑色素短

梗霉对碳源和氨基酸的利用能力导致碳代谢流向TCA循环中的苹果酸从而促进

聚苹果酸合成。

3

（）通过液质联用进行非靶向代谢组学检测发酵前中后期三个时间节点胞

内代谢物变化，数据预处理及样品差异分析后进行KEGG富集，发现与PMLA

有关的代谢途径的有糖酵解途径、磷酸戊糖途径、TCA循环、尿素循环等。通

过对差异代谢物的分析发现玉米浆的添加使菌体积累了柠檬酸、丙酮酸、琥珀酸

和苹果酸，同时实验组的果糖、葡萄糖的含量明显高于空白组，为糖酵解途径补

充关键中间体，加强了糖酵解途径；推测尿素循环的加强为苹果酸合成提供了更

多的延胡索酸，因此添加玉米浆是提高PMLA产量的有效方法。

4

（）对转录组的差异基因结果中差异表达量较大的酸性磷酸酶调控基因

PHO4进行研究，酸性磷酸酶调控基因直接参加磷代谢，并在钙离子的消化、吸

收和分泌过程中发挥重要作用。对产黑色素短梗霉的原生质体的形成和再生条件

进行了探究，基于PEG介导同源重组改造手段，构建了对目的基因敲除验证，

并对敲除菌株进行发酵验证，发现PHO4基因对菌体生长和PMLA合成均有一

定的影响。

关键词：产黑色短梗霉；聚苹果酸；玉米浆；转录组学；代谢组学；同源重

组

ABSTRACT

Polymalicacidisanewpolymericmaterialthathasbeenwidelystudiedand

appliedinmedical,environmentalandmater